实时定量PCR法在肝癌细胞β2 M mRNA检测中的应用

目的探讨实时定量PCR法检测肝癌细胞β2微球蛋白(β2M)mRNA的应用价值。方法采用2-ΔΔCT定量PCR法检测肝癌SMMC 7721细胞株β2M mRNA表达水平。结果预实验确定目的基因(β2M)和内参基因(β-actin)的扩增效率较为一致。肝癌细胞中β2M基因表达水平明显低于正常肝细胞株L02(P<0.05)。结论2-ΔΔCT定量PCR法为定量检测肝癌细胞β2M基因的较好方法;可用于β2M在肝癌细胞中表达调控的研究。     

蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白基因的融合表达和活性测定

目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白 (GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究.方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;GFP-RTA经PCR扩增,与T载体连接,用内切酶从T-GFP-RTA中切下GFP-RTA片段,插入原核表达质粒pET-28a( );在BL21(DE3)中表达GFP-RTA融合蛋白,通过金属螯合和层析纯化,MTT法检测融合蛋白的细胞毒性.结果:测序发现插入的融合基因全长序列完全正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确;经诱导表达后,菌体产生绿色荧光,MTT法表明该融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性.结论:从大肠杆菌表达的蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白的融合蛋白,具有蓖麻毒素A链和绿色荧光蛋白的生物学活性,可用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运途径研究.