捕获噬菌体酶联免疫吸附法筛选抗去唾液酸糖蛋白受体单链抗体的价值

目的评价捕获噬菌体酶免疫吸附试验法(ELISA)在筛选抗去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单链抗体(scFv)中的价值。方法以含ASGPR基因的质粒(CRDH1/pET3b)为模板,通过聚合酶链反应扩增获得ASGPRH1亚单位糖识别区基因(CRDH1),定向克隆至原核表达载体pET-32c,并经IPTG诱导表达,其表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化;然后,采用捕获噬菌体ELISA对人源噬菌体抗体库进行筛选和鉴定,同时对筛选的抗CRDH1单链抗体进行DNA测序、表达、纯化和免疫印记鉴定。然后,与间接噬菌体ELISA比较。结果CRDH1/pET-32c在原核系统中经诱导表达出分子量约35000的融合蛋白,且以包涵体形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白后,采用捕获噬菌体ELISA进行四轮筛选,在60个噬菌体克隆中有45株与CRDH1特异性结合,其中仅1株与重组蛋白标签有交叉结合反应。DNA序列分析表明,有9株DNA序列各异,9株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的scFv,纯化的scFv也可特异性识别rCRDH1。计算该筛选方法的假阳性率为2%,低于间接噬菌体ELISA筛选的假阳性率(58%)。结论捕获噬菌体ELISA筛选CRDH1特异性scFv可有效降低硫氧还蛋白标签(Trx·Tag)引起的假阳性,提高筛选阳性率,并成功筛选出9株具有rCRDH1特异性的scFv。     

完全腹腔镜下胰腺钩突部肿瘤切除术的临床疗效分析（附3例报告）

目的 探讨完全腹腔镜下手术切除治疗胰腺钩突部肿瘤的临床疗效。方法 回顾性分析深圳大学总医院2017年3月以来3例行完全腹腔镜下胰腺钩突部肿瘤切除术的患者的临床资料,总结围手术期处理方法及临床效果。结果 3例患者均于完全腹腔镜下完成手术,术后1例有A级胰瘘,经应用胰酶抑制剂和肠外营养支持等治疗后痊愈;1例发生胃肠道功能障碍,经胃肠减压和肠外营养支持治疗后痊愈;1例神经内分泌肿瘤患者手术切除肿瘤后症状缓解,未再发作低血糖昏迷,空腹及餐后血糖水平明显升高,血清胰岛素水平均较术前明显降低,恢复正常胰岛素分泌波峰。无出血和腹腔感染等严重并发症发生;无围手术期死亡病例。3例患者术后均痊愈出院,随访13～47个月无异常。结论 完全腹腔镜下胰腺钩突部肿瘤切除术安全可行,疗效好,可用于胰腺钩突部良性或神经内分泌肿瘤的切除。     

HIF-1仪和HIF-2α在肝癌细胞中的时相差异表达

背景与目的：缺氧诱导因子2cL（hypoxia inducible factor-2 alpha，HIF-2旺）与缺氧诱导因子1仪结构功能相似却不可相互替代；两者在缺氧过程中的表达不一致本研究旨在检测缺氧状态下肝癌细胞中HIF-2a和HIF-1α的时相表达差异并探讨其可能的调节机制和意义方法：以1％低氧培养箱模拟细胞低氧环境，检测人肝癌SMMC-7721细胞中HIF-1α和HIF-2α mRNA量和蛋白量，以及反义HIF-1α（natural antisense hypoxia inducible factor-1α，aHIF）的mRNA量。同时应用氯化钻（CoCl2）和转录抑制剂5，6-二氯苯并咪唑1-beta-D-呋喃核糖苷（5，6-dichlorobenzimida-zole-1-beta-d-ribofuranoside，DRB）榆测HIF-1α和HIF-2α mRNA的半衰期，评价HIF-1α和HIF-2α mRNA的稳定性。结果：急性缺氧迅速诱导HIF-1α和HIF-2α蛋白在细胞内堆积。随着缺氧时间延长HIF-1α mRNA的稳定性下降，其蛋白表达降低，而HIF-2α和aHIF蛋白表达持续增高。结论：HIF-2d可能在肿瘤的放疗和化疗抗性以及与肿瘤侵袭和转移方面起着重要作用，αHIF参与了HIF-1α mRNA的调节。     

靶向去唾液酸糖蛋白受体多功能分子的构建及抗肝癌效应

目的 构建具有靶向去唾液酸糖蛋白受体、溶酶体逃逸、DNA结合的多功能融合蛋白,并对表达产物进行功能鉴定.方法 合成编码Melittin的两条寡核苷酸单链(GenBank:X02007),退火形成寡核苷酸双链;双酶切含抗去唾液酸糖蛋白单链抗体( ASGPR scFv) C1基因的载体C1/pIT2,0.7％低融点琼脂糖凝胶回收C1;以pSW50-Gal4为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增Gal4基因;采用分子克隆技术将其定向克隆至载体pGC4C26H中,获得重组质粒C1 MG/pGC4C26H;双酶切载体C1MG/pGG4C26H,胶回收片段C1MG定向克隆至载体pET-32c中,将含C1MG/pET-32c的BL21单菌落1∶100接种至1000 ml LB肉汤培养基中培养,并通过IPTG诱导表达.表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹技术( Western blot)和免疫组织化学分析重组蛋白C1 MG的抗原结合能力,溶血实验分析C1MG的生物学活性,肿瘤细胞生长抑制实验分析C1MG的DNA结合能力.结果 成功构建原核表达质粒C1MG/pET-32c,并经测序证实:在大肠杆菌BL21中有效表达重组融合蛋白C1MG;表达产物以包涵体形式存在;纯化的C1 MG大小为64.1 kDa,浓度为0.6g/L;Western blot结果说明C1MG能有效识别重组ASGPR,免疫组织化学结果证实C1 MG能结合到鼠肝细胞表面;溶血实验显示ClMG具有裂解红细胞膜功能;肿瘤细胞生长抑制实验证实C1 MG将pEBAF/tk-GAL4rec质粒有效地导入表达ASGPR的细胞中并表达TK基因,氯喹对肿瘤细胞生长抑制无明显影响.结论 在大肠杆菌中成功表达和纯化得到单链抗体-蜂毒肽-酵母转录因子(C1MG)的融合蛋白,该融合蛋白至少具有以下功能:ASGPR靶向识别能力、溶酶体膜裂解功能、以及DNA特异性结合功能,提示对肝癌的靶向治疗有潜在的应用价值.     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚基的原核表达及多克隆抗体的制备

目的在原核系统中表达并纯化去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）H1亚基，制备兔抗人ASGPR1多克隆抗体。方法以质粒pEA1为模板，设计引物，将聚合酶链反应（PCR）扩增产物H1基因克隆到原核表达载体pET-32c中。接种含H1/pET-32c的菌株BL21单菌落至LB肉汤中，1∶100稀释转种后用1 mmol/L终浓度的异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，表达产物用Ni^2＋螯合柱亲和纯化，用纯化的ASGPR1免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果H1/pET-32c在原核系统中成功表达和纯化出约50.3 kD大小的融合蛋白，用纯化的H1成功制备了兔抗人H1多克隆抗体，并用6His-H1和GST-H1重组蛋白进行免疫印迹技术（Western blot）分析，证实了抗体的正确性。结论应用多克隆抗体可以检测体内外ASGPR H1亚基基因的表达，为临床上测定血清可溶性ASGPR奠定基础。     

去唾液酸糖蛋白受体特异性单链抗体的优化表达及亲和常数的测定

目的:表达及纯化抗去唾液酸糖蛋白受体(ASG-PR)的单链抗体的可溶性,并测定其亲和常数。方法:用噬菌体C1克隆感染E.coliHB2151,挑取单个菌落接种于2×TY培养基中,于37℃震荡培养过夜。将培养物作1∶100稀释并转种后,用终浓度为0.25、0.5、1.0mmol/L的IPTG,分别在37℃、25℃和20℃下诱导表达过夜。取其培养上清,用饱和硫酸铵沉淀后,以120g/LSDS-PAGE分析。另外,将饱和硫酸铵沉淀物用30mLPBS重新溶解、透析除盐后,用Ni2 螯合柱进行纯化,再以120g/LSDS-PAGE鉴定纯化scFvC1的纯度。用非竞争酶免疫法测定scFv的亲和常数。结果:用0.5mmol/LIPTG在25℃诱导过夜,表达的scFvC1的量较多,其相对分子质量(Mr)约为28000,以可溶性的形式存在于培养基中。通过Ni2 亲和柱纯化后scFvC1的纯度在95%以上,产量约为0.8mg/L。scFv的亲和常数为(2.31±0.36)×10-7mol/L。结论:以筛选的C1噬菌体感染E.coliHB2151后可表达低亲和力的可溶性scFv,对肝癌的基因治疗具有潜在的应用价值。     

门静脉高压症合并脾动脉瘤的腹腔镜/开放同期手术治疗效果分析（附28例报告）

目的 比较门静脉高压症合并脾动脉瘤患者同期行腹腔镜/开放手术（脾动脉瘤近心端及远心端隔绝术、脾脏切除术和门-奇断流术）的临床治疗效果。方法 回顾性分析2013年1月-2020年12月28例于武汉市第一医院肝胆外科和深圳大学总医院普外科诊断为“门静脉高压症、脾功能亢进合并脾动脉瘤”的患者的临床资料,所有病例均同期腹腔镜下或者开放手术下应用“脾动脉瘤近、远心端隔绝术+脾切除术+门-奇断流术”进行治疗。患者术前均需完善腹部增强CT+CT血管造影（CTA）、彩色多普勒超声以及胃镜等检查,详细了解肝功能分级、脾脏肿大分级、脾功能亢进程度、食管胃底静脉曲张程度、脾动脉瘤在载瘤动脉上的位置、大小、外形以及与周围器官的毗邻关系等情况。术后常规复查血液分析、C反应蛋白（CRP）和肝功能。术后1～3个月门诊复查腹部增强CTA。术后门诊及电话随访7～84个月。结果 所有患者均痊愈,无腹腔积液、感染、深部脓肿、出血和胰瘘等术后并发症,围手术期及随访期间无死亡病例。腹腔镜手术组手术时间和术后住院时间较开放手术组短,术中出血量和术后3 d腹水量较开放手术组少,差异均有统计学意义（P <0.05）。术后第3天...     

半乳糖基多聚赖氨酸携带HSV1-TK对HepG2细胞体外效应研究

目的为肝癌的自杀基因治疗寻找新的靶向分子方法通过还原氨化法进行乳糖（Lac）与聚赖氨酸（PLL）共价连接；经Sephadex G-10枉分离纯化；以苯酚-硫酸比色法测定n值；与真核表达质粒r-pAs16Dr按比例混匀，得到GlanPLL-r-pAs16Dr基因转移系统；分别转染不同的细胞株进行体外效应研究：人肝癌细胞株HepC2、人肺癌细胞株549，观察报告基因红色荧光蛋白能否在肝细胞中表达；RT—PCR检测HSV—tk基因的表达情况；观察给予不同浓度的更昔洛韦（GCV）后随时间延长细胞改变情况，用MTT法检测GCV对不同细胞的杀伤作用。结果化学合成得到34个半乳糖基的PLL；转染后48h在HepG2可见红色荧光蛋白表达，A549细胞未见红色荧光蛋白表达；RT-PCR证实HSV—tk仅在HepG2细胞中表达：体外杀伤实验显示：经GlanPLL-r-pAs16Dr基因转移系统处理的两种细胞对GCV表现出不同的敏感性HepG2细胞对GCV很敏感，低浓度的GCV（1mg／L）处理3d．即可使细胞生长抑制率达到70．5％，A549对GCV不敏感结论半乳糖基多聚赖氨酸能够与ASGPR有效的结合，合成配体来源丰富、制备简单，适合于作为自杀基因HSV—tk肝靶向运送的导向配体。     

大鼠脑挫伤后诱导型一氧化氮合成酶的表达及其时相性研究

①目的 探讨大鼠实验性脑挫伤后诱早型一氧化氮合成酶(iNOS)的表达及其时相性。②方法 建立脑挫伤动物实验模型，采用免疫组织化学技术(SABC法)，观察大鼠脑挫伤后iNOS在伤后不同时间的表达。免疫组化结果利用计算机彩色图像分析技术进行定量统计分析处理。③结果 伤后12小时组可见iNOS活性增高，并随伤后存活时间延长，iNOS阳性物质总面积逐渐增多，细胞染色强度逐渐加深。阳性物质总面积在伤后1～3天这高峰，5天后开始下降，伤后7天仍维持较高水平。细胞染色强度亦随伤后存活时间的延长而加深，于伤后5天时达高峰，随后骤然下降，至伤后7天仍高于起始水平。④结论 脑挫伤后iNOS在损伤局部的染色变化呈现一定的时间规律性，可用于脑挫伤时间的推断。