柠檬酸化半水硫酸钙作为骨移植替代材料的安全性及生物相容性评价

目的：以二水硫酸钙为原料，制备出高纯度柠檬酸化半水硫酸钙，并对其生物相容性进行评价。方法：实验于2004-09／2005-01在解放军总医院骨科研究所完成。柠檬酸化半水硫酸钙粉沫是粉状的二水硫酸钙经特殊处理制得。根据文献对实验材料进行生物相容性及安全性评价实验。①红细胞溶解性：材料粉末制备的浸提液加入抗凝兔血内恒温水浴60min、离心取上清液，分光光度计测定上清液吸光度。计算红细胞溶血率（％）=（实验组吸光度-阴性对照组吸光度）／（阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度）&;#215;100％、标准：≤5％为正常。②细胞毒性试验：采用四甲基偶氮唑盐比色法。兔骨髓基质干细胞经复苏、传代、培养24h后进行更换含材料浸提液的培养基继续培养、酶标仪测定1，3，5，7d吸光度。计算细胞相对增值率=实验组吸光度／对照组吸光度。③细胞材料表面贴附：骨髓基质干细胞细胞悬液滴在材料表面，培养3d后，倒置显微镜下观察材料边缘细胞生长情况。乙醇固定后用环境扫描电镜镜下观察材料表面的细胞贴附情况。④热源性：自体温试验筛选合格新西兰家兔的耳缘静脉注入材料浸提液后，定时测兔体温。标准：每只体温升高在0．6℃以下，3只体温升高总度数小于1．4℃。⑤皮肤刺激性：健康新西兰家兔脊柱两侧选点注射材料花生油及DMEM浸提液，每个点注射0．2mL。观察注射部位皮肤反应。⑥致敏性：将浸提液与完全氟氏佐剂完全乳化制成相应剂型试剂，以豚鼠为观察对象，观察腹部激发部位皮肤反应。结果：①材料特性：制备材料2h固化抗压缩强度达到26MPa，初凝时间5rain，终凝时间20min。扫描电镜观察为晶体形态均一、为规则的六面体结构。②细胞粘附与生长形态：骨髓基质干细胞在材料周围生长．环境扫描电镜观察细胞贴附材料表面生长，呈不规则的梭形、多角形，胞体伸出伪足长短不等。③红细胞溶解实验：红细胞溶血率为0．34％，远小于阳性标准，说明材料植入体内后不会引起机体本身的溶血反应。④热源反应：家兔平均体温升高为0．1℃，符合医用材料的热源反应要求，说明本材料本身不具有致热源作用。⑤皮内注射：两组浸提液皮内注射后均未引起家兔实验区的红斑及水肿反应，提示材料对动物机体没有刺激性。⑥致敏实验：致敏率为0，与阴性对照没有差别，说明材料没有致敏性。⑦细胞毒性实验的检测结果提示实验组细胞相对增值率和对照组无显著性差别，评分为0～1级，说明材料本身不具有细胞毒性。结论：生物安全性评价结果初步显示制备的材料具有良好的生物相容性，符合医用生物材料的基本要求。     

柠檬酸化硫酸钙和Osteoset动物体内植入比较性研究

[目的] 探讨柠檬酸化硫酸钙和Osteoset对周围组织作用及对骨修复活动的影响。[方法] 建立兔股骨远端包容性骨缺损模型，用柠檬酸化硫酸钙和Osteoset填充缺损，进行一般观察、大体X线及骨组织学计量分析。[结果] 空白对照组仅在缺损区边缘有少量的新生骨组织，中央被骨髓组织填充替代。缺损区填充的CCaS和Osteoset逐渐降解吸收，被新生的骨组织替代，新生骨组织随时间逐渐成熟。骨小梁逐渐增粗。3、6、13周时CCaS和Osteoset缺损区内新生骨组织量及骨小梁粗度两者无显著性差异。3周时，缺损区内CCaS和0steoset部分吸收，材料周围有新生骨组织，周边组织未见淋巴细胞浸润及异物巨细胞反应，材料剩余量CCaS组多于0steoset组（t=21．2，P=0）。[结论] 柠檬酸化硫酸钙和Osteoset性质相似、能够修复骨缺损、具有骨传导作用，材料对周围组织无炎症刺激及异物刺激反应。柠檬酸化硫酸钙的降解速度慢于Osteoset，其降解速度更接近于新骨形成速度．有利于新骨的形成，是一种有前途的骨移植替代材料。     

鹰嘴豆异黄酮提取物对糖尿病小鼠血糖和氧化一抗氧化态的效应

目的：通过观察鹰嘴豆异黄酮对糖尿病小鼠血糖及氧化-抗氧化效应的影响，探讨其降糖机制。方法：实验于2006—08／10在中国药科大学药理教研室动物实验中心完成。①选用清洁级昆明种小白鼠50只进行造模：小鼠以高糖高脂饲料喂养4周后，按25mg／kg剂量一次尾静脉注射链脲佐菌素，注射7d后血糖升高稳定、且随机血糖达16．7mmol／L以上者为造模成功。②随机将造模成功的小鼠50只均分为5组：高血糖模型对照组、二甲双胍治疗组、鹰嘴豆异黄酮提取物低、中、高剂量组，每组10只。在各组给予高糖高脂饲料的基础上，鹰嘴豆异黄酮提取物3个剂量组分别给予25mg／kg、50mg／kg、100mg，kg的受试物，高血糖模型对照组和二甲双胍治疗组分别给予150mg／kg的蒸馏水和二甲双胍，1次/d。连续4周。③给药2周末和4周末监测空腹血糖，实验结束时于空腹12h后将小鼠处死，取血和肝脏组织，测定血清及肝组织中丙二醛含量及超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性。结果：纳入50只小鼠均进入结果分析。①空腹血糖：给予鹰嘴豆异黄酮提取物2周后，高剂量组与二甲双胍治疗组小鼠血糖值显著低于高血糖模型对照组（P〈0．05），且二者间差异无显著性；4周后，高、中剂量组均显著低于高血糖模型对照组（P〈0．05），二甲双胍治疗组极显著低于高血糖模型对照组（P〈0．01）；高、中剂量组与二甲双胍治疗组间差异无显著性。②丙二醛含量：与高血糖模型对照组相比，中剂量组和二甲双胍治疗组血清和肝脏中丙二醛含量均显著降低（P〈0．05），高剂量组呈极显著降低（P〈0．01），且高剂量组血清中丙二醛含量显著低于二甲双胍治疗组（P〈0．05）。③超氧化物歧化酶活性：中、高剂量组和二甲双胍治疗组血清和肝脏中超氧化物歧化酶活性均高于高血糖模型对照组（P〈0．05）。④过氧化氢酶活性：中、高剂量组血清和高剂量组肝脏中过氧化氢酶活性高于高血糖模型对照组（P〈0．05，P〈0．01，P〈0．05），高剂量组血清和肝脏中过氧化氢酶活性均显著高于二甲双胍治疗组（P〈0．05），而二甲双胍治疗组无论血清还是肝脏中过氧化氢酶活性与高血糖模型对照组相比差异无显著性（P〉0．05）。⑤谷胱甘肽过氧化物酶活性：中、高剂量组血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性均高于高血糖模型对照组（P〈0．01）；各剂量组肝脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性均高于高血糖模型对照组（P〈0．01）；二甲双胍治疗组血清和肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶活性均显著高于高血糖模型对照组（P〈0．05），但肝脏中活性仍极显著低于3个剂量组（P〈0．01）。⑥给药后，模型鼠的血糖与血清超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性的相关系数分别为-0．9403、-0．9466和-0．9503；与肝脏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性的相关系数分别为-0．9436、-0．9356和-0．9631。结论：①鹰嘴豆异黄酮提取物有显著的降血糖作用。（固鹰嘴豆异黄酮提取物降血糖作用的机制可能与其提高抗氧自由基酶类的活性，保护机体组织免遭过氧化损伤有关。②鹰嘴豆异黄酮提取物在降低过氧化产物丙二醛含量、增强机体抗氧化能力方面的功能优于治疗糖尿病的常用药物二甲双胍。     

鹰嘴豆异黄酮提取物对糖尿病小鼠血糖和氧化-抗氧化态的效应

目的:通过观察鹰嘴豆异黄酮对糖尿病小鼠血糖及氧化-抗氧化效应的影响,探讨其降糖机制。方法:实验于2006-08/10在中国药科大学药理教研室动物实验中心完成。①选用清洁级昆明种小白鼠50只进行造模:小鼠以高糖高脂饲料喂养4周后,按25mg/kg剂量一次尾静脉注射链脲佐菌素,注射7d后血糖升高稳定、且随机血糖达16.7mmol/L以上者为造模成功。②随机将造模成功的小鼠50只均分为5组:高血糖模型对照组、二甲双胍治疗组、鹰嘴豆异黄酮提取物低、中、高剂量组,每组10只。在各组给予高糖高脂饲料的基础上,鹰嘴豆异黄酮提取物3个剂量组分别给予25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的受试物,高血糖模型对照组和二甲双胍治疗组分别给予150mg/kg的蒸馏水和二甲双胍,1次/d,连续4周。③给药2周末和4周末监测空腹血糖,实验结束时于空腹12h后将小鼠处死,取血和肝脏组织,测定血清及肝组织中丙二醛含量及超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性。结果:纳入50只小鼠均进入结果分析。①空腹血糖:给予鹰嘴豆异黄酮提取物2周后,高剂量组与二甲双胍治疗组小鼠血糖值显著低于高血糖模型对照组(P<0.05),且二者间差异无显著性;4周后,高、中剂量组均显著低于高血糖模型对照组(P<0.05),二甲双胍治疗组极显著低于高血糖模型对照组(P<0.01);高、中剂量组与二甲双胍治疗组间差异无显著性。②丙二醛含量:与高血糖模型对照组相比,中剂量组和二甲双胍治疗组血清和肝脏中丙二醛含量均显著降低(P<0.05),高剂量组呈极显著降低(P<0.01),且高剂量组血清中丙二醛含量显著低于二甲双胍治疗组(P<0.05)。③超氧化物歧化酶活性:中、高剂量组和二甲双胍治疗组血清和肝脏中超氧化物歧化酶活性均高于高血糖模型对照组(P<0.05)。④过氧化氢酶活性:中、高剂量组血清和高剂量组肝脏中过氧化氢酶活性高于高血糖模型对照组(P<0.05,P<0.01,P<0.05),高剂量组血清和肝脏中过氧化氢酶活性均显著高于二甲双胍治疗组(P<0.05),而二甲双胍治疗组无论血清还是肝脏中过氧化氢酶活性与高血糖模型对照组相比差异无显著性(P>0.05)。⑤谷胱甘肽过氧化物酶活性:中、高剂量组血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性均高于高血糖模型对照组(P<0.01);各剂量组肝脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性均高于高血糖模型对照组(P<0.01);二甲双胍治疗组血清和肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶活性均显著高于高血糖模型对照组(P<0.05),但肝脏中活性仍极显著低于3个剂量组(P<0.01)。⑥给药后,模型鼠的血糖与血清超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性的相关系数分别为-0.9403、-0.9466和-0.9503;与肝脏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性的相关系数分别为-0.9436、-0.9356和-0.9631。结论:①鹰嘴豆异黄酮提取物有显著的降血糖作用。②鹰嘴豆异黄酮提取物降血糖作用的机制可能与其提高抗氧自由基酶类的活性,保护机体组织免遭过氧化损伤有关。③鹰嘴豆异黄酮提取物在降低过氧化产物丙二醛含量、增强机体抗氧化能力方面的功能优于治疗糖尿病的常用药物二甲双胍。     

柠檬酸化半水硫酸钙作为骨移植替代材料的安全性及生物相容性评价

目的:以二水硫酸钙为原料,制备出高纯度柠檬酸化半水硫酸钙,并对其生物相容性进行评价。方法:实验于2004-09/2005-01在解放军总医院骨科研究所完成。柠檬酸化半水硫酸钙粉沫是粉状的二水硫酸钙经特殊处理制得。根据文献对实验材料进行生物相容性及安全性评价实验。①红细胞溶解性:材料粉末制备的浸提液加入抗凝兔血内恒温水浴60min、离心取上清液,分光光度计测定上清液吸光度。计算红细胞溶血率(%)=(实验组吸光度-阴性对照组吸光度)/(阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度)×100%、标准:≤5%为正常。②细胞毒性试验:采用四甲基偶氮唑盐比色法。兔骨髓基质干细胞经复苏、传代、培养24h后进行更换含材料浸提液的培养基继续培养、酶标仪测定1,3,5,7d吸光度。计算细胞相对增值率=实验组吸光度/对照组吸光度。③细胞材料表面贴附:骨髓基质干细胞细胞悬液滴在材料表面,培养3d后,倒置显微镜下观察材料边缘细胞生长情况。乙醇固定后用环境扫描电镜镜下观察材料表面的细胞贴附情况。④热源性:自体温试验筛选合格新西兰家兔的耳缘静脉注入材料浸提液后,定时测兔体温。标准:每只体温升高在0.6℃以下,3只体温升高总度数小于1.4℃。⑤皮肤刺激性:健康新西兰家兔脊柱两侧选点注射材料花生油及DMEM浸提液,每个点注射0.2mL。观察注射部位皮肤反应。⑥致敏性:将浸提液与完全氟氏佐剂完全乳化制成相应剂型试剂,以豚鼠为观察对象,观察腹部激发部位皮肤反应。结果:①材料特性:制备材料2h固化抗压缩强度达到26MPa,初凝时间5min,终凝时间20min。扫描电镜观察为晶体形态均一、为规则的六面体结构。②细胞粘附与生长形态:骨髓基质干细胞在材料周围生长,环境扫描电镜观察细胞贴附材料表面生长,呈不规则的梭形、多角形,胞体伸出伪足长短不等。③红细胞溶解实验:红细胞溶血率为0.34%,远小于阳性标准,说明材料植入体内后不会引起机体本身的溶血反应。④热源反应:家兔平均体温升高为0.1℃,符合医用材料的热源反应要求,说明本材料本身不具有致热源作用。⑤皮内注射:两组浸提液皮内注射后均未引起家兔实验区的红斑及水肿反应,提示材料对动物机体没有刺激性。⑥致敏实验:致敏率为0,与阴性对照没有差别,说明材料没有致敏性。⑦细胞毒性实验的检测结果提示实验组细胞相对增值率和对照组无显著性差别,评分为0～1级,说明材料本身不具有细胞毒性。结论:生物安全性评价结果初步显示制备的材料具有良好的生物相容性,符合医用生物材料的基本要求。     

柠檬酸化硫酸钙和Osteoset~动物体内植入比较性研究

[目的]探讨柠檬酸化硫酸钙和Osteose t对周围组织作用及对骨修复活动的影响。[方法]建立兔股骨远端包容性骨缺损模型,用柠檬酸化硫酸钙和Osteose t填充缺损,进行一般观察、大体X线及骨组织学计量分析。[结果]空白对照组仅在缺损区边缘有少量的新生骨组织,中央被骨髓组织填充替代。缺损区填充的CCaS和Osteo-se t逐渐降解吸收,被新生的骨组织替代,新生骨组织随时间逐渐成熟,骨小梁逐渐增粗。3、6、13周时CCaS和Osteoset缺损区内新生骨组织量及骨小梁粗度两者无显著性差异。3周时,缺损区内CCaS和Osteose t部分吸收,材料周围有新生骨组织,周边组织未见淋巴细胞浸润及异物巨细胞反应,材料剩余量CCaS组多于Osteose t组(t=21.2,P=0)。[结论]柠檬酸化硫酸钙和Osteose t性质相似、能够修复骨缺损、具有骨传导作用,材料对周围组织无炎症刺激及异物刺激反应。柠檬酸化硫酸钙的降解速度慢于Osteose t,其降解速度更接近于新骨形成速度,有利于新骨的形成,是一种有前途的骨移植替代材料。     

柠檬酸化硫酸钙和Osteoset(R)动物体内植入比较性研究

[目的]探讨柠檬酸化硫酸钙和Osteoset(R)对周围组织作用及对骨修复活动的影响.[方法]建立兔股骨远端包容性骨缺损模型,用柠檬酸化硫酸钙和Osteoset(R)填充缺损,进行一般观察、大体X线及骨组织学计量分析.[结果]空白对照组仅在缺损区边缘有少量的新生骨组织,中央被骨髓组织填充替代.缺损区填充的CCaS和Osteoset(R)逐渐降解吸收,被新生的骨组织替代,新生骨组织随时间逐渐成熟,骨小梁逐渐增粗.3、6、13周时CCaS和Osteoset(R)缺损区内新生骨组织量及骨小梁粗度两者无显著性差异.3周时,缺损区内CCaS和Osteoset(R)部分吸收,材料周围有新生骨组织,周边组织未见淋巴细胞浸润及异物巨细胞反应,材料剩余量CCaS组多于Osteoset(R)组(t=21.2,P=0).[结论]柠檬酸化硫酸钙和Osteoset(R)性质相似、能够修复骨缺损、具有骨传导作用,材料对周围组织无炎症刺激及异物刺激反应.柠檬酸化硫酸钙的降解速度慢于Osteoset(R),其降解速度更接近于新骨形成速度,有利于新骨的形成,是一种有前途的骨移植替代材料.     

柠檬酸化硫酸钙对鼠成骨细胞增殖、分化的影响

目的:观察柠檬酸化硫酸钙对成骨细胞功能的影响,探讨该材料作为骨移植替代材料的可行性。方法:采用体外培养成骨细胞的方法,观察材料浸提液对成骨细胞增殖、碱性磷酸酶和骨钙素分泌能力的影响。结果:在100%浓度柠檬酸化硫酸钙浸提液中培养的成骨细胞增殖相对缓慢(但相对增殖率>90%),其细胞核内嗜银蛋白颗粒染色分析与对照组无显著性差异(P>0.05),其分泌骨钙素、碱性磷酸酶能力显著高于对照组(P<0.01)。结论:柠檬酸化硫酸钙对成骨细胞不具有细胞毒性作用,随着硫酸钙的溶解,在材料植入部位的局部形成高钙环境,这有利于成骨细胞的增殖和分化促进新骨的形成。