HIV-1假病毒包装方法的探讨

目的：通过不同方案包装HIV-1假病毒,确定获得高重复性、高稳定性和高滴度假病毒的方法。方法从转染效率影响因素出发,通过不同的转染方案,利用pNL4-3 LucR-E-质粒与VSV-G质粒共转染293细胞包装病毒,分别于48 h和72 h收取假病毒并重新感染293细胞,48 h后测荧光素酶报告基因。结果成功包装出HIV-1假病毒,不同包装方案的病毒滴度不同,测得报告基因最高接近107 RLUs。结论应用PEI转染试剂、大提质粒pNL4-3︰VSV-G为4︰1时,转染效率最高,包装的假病毒滴度最高。     

带有CFP标签的LC3自噬表达载体的构建

目的构建带有樱桃红色荧光蛋白(cherry fluorescent protein,CFP)标签的微管相关蛋白1轻链3(LC3)自噬真核表达载体,并进行初步表达鉴定。方法采用PCR方法,从质粒载体pCMV-GFP-LC3为模板扩增LC3片段,通过T4 DNA连接酶将纯化后的PCR产物LC3与经过ApaI和BamHI双酶切的pm-cherry-c1载体连接,命名为PM-CFP-LC3。该载体经酶切及测序验证后,在fugene6转染试剂介导下转染293细胞,通过荧光显微镜观察CFP在细胞内的分布来观察LC3表达情况。结果带有CFP标签的LC3表达载体构建成功,在荧光显微镜下可观察到转染细胞中樱桃红色荧光以及细胞自噬现象。结论成功构建了带有CFP标签LC3的重组质粒并成功表达,为深入研究细胞的自噬奠定了实验基础。     

射频消融亚致死性温度对肝癌干细胞的影响

目的 研究亚致死温度射频消融(RFA)对肝癌干细胞(LCSC)产生及其相关转录因子表达的影响.方法 利用小鼠Hep1-6肝癌细胞株和肝细胞癌(HCC)患者临床样品,检测LCSC相关标志物和转录因子的表达.结果 不同温度分别刺激Hep1-6细胞后发现,45℃是不能诱导细胞死亡的亚致死性温度.流式细胞仪(FCM)检测显示45℃处理可引起CD13+、CD44+、CD90+、CD133+ Hep1-6细胞水平明显上调,提示45℃温度导致Hep1-6细胞中以上各型LCSC产生增加;实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测显示45℃温度导致CD13、CD90、CD133 mRNA水平明显上调.CD13 mRNA水平在5例HCC患者复发肝癌组织中均明显上调,CD133 mRNA在4例复发肝癌中上调,CD90 mRNA仅在1例复发肝癌中上调;FCM检测显示CD13+ LCSC水平在4例复发肝癌中明显上调,CD133+ LCSC水平仅在1例复发肝癌中上调,提示CD13+ LCSC水平上调与45℃温度关系更密切.RT-qPCR检测显示4例CD13+ LCSC上调的复发肝癌患者13个LCSC相关转录因子中Sox2、Stat1明显上调,FCM检测显示45℃处理Hep1-6细胞后Sox2、Stat1 mRNA明显上调.用Sox2、Stat1 siRNA分别沉默了Sox2、Stat1基因,表明Sox2 、Stat1均参与了45℃温度诱导的CD13+ LCSC产生.结论 RFA治疗中45℃亚致死性温度所致CD13+ LCSC水平增高与Sox2、Stat1表达有关.该结果对肝癌复发研究有一定借鉴意义.     

HIV-1膜蛋白gp120V3环的神经毒性研究

目的 体外观察人类免疫缺陷病毒-1（human immunodeficiency virus-1,HIV-1）膜蛋白gp120 V3环的神经毒性.方法通过小鼠大脑皮质原代神经细胞培养条件下TUNEL检测和培养上清乳酸脱氢酶释放试验,结合抗微管蛋白-2（microtubule associated protein-2,MAP-2）免疫荧光试验,观察人重组gp120蛋白神经毒性,并通过蛋白印迹法初步探讨其与凋亡调控蛋白bax与bcl-2的关系.结果重组人gp120 V3环多肽可诱导神经元凋亡和抑制神经突起形成,并呈浓度依赖性.gp120 V3环诱导神经细胞凋亡与抑制bcl-2表达有关.结论 HIV-1膜蛋白gp120 V3环具有神经毒性.     

饥饿诱导DRAM介导的自噬与HepG2和Hep3B细胞凋亡的关系

目的探讨饥饿诱导损伤调节自噬调控基因(DRAM)介导的自噬在HepG2细胞和Hep3B细胞凋亡中的作用。方法 HepG2细胞和Hep3B细胞经饥饿处理后,观察DRAM的表达和自噬的发生;利用DRAM小干扰RNA(siRNA)阻断DRAM,观察饥饿诱导的自噬水平;采用Calcein AM/PI染色,观察DRAM siRNA对饥饿引起的细胞凋亡的影响。结果经饥饿处理后12、24、36h,HepG2细胞和Hep3B细胞内DRAMmRNA均显著高于处理前(P﹤0.001),细胞凋亡明显增加(P﹤0.01),但两种细胞系间细胞凋亡计数的差异无统计学意义。DRAM siRNA阻断DRAM的功能后,HepG2和Hep3B细胞自噬减少,但对饥饿引起的细胞凋亡没有明显影响。结论 DRAM参与了饥饿诱导的自噬,可能不是饥饿引起肝癌细胞凋亡的机制。     

核苷类似物对小鼠中枢神经线粒体毒性研究

目的探讨长期使用核苷类似物是否产生中枢神经元线粒体损伤。方法取7周龄Balb/C小鼠40只,分为4组,每组10只。实验组每天分别喂饲司它夫定（D4T）50 mg/kg、齐多夫定（AZT）100 mg/kg和拉米夫定（3TC）50 mg/kg,每周5 d,连续16周;对照组喂服双蒸水。通过激光单细胞捕获技术抓取小鼠大脑皮层神经元,每组200个细胞,通过实时定量PCR观察线粒体DNA（mtDNA）含量变化。结果 COXⅡ基因扩增显示,喂饲核苷类似物可明显减低小鼠大脑皮层神经元mtDNA拷贝数,其中D4T组减少至对照组的（22.2±3.2）%,AZT组减少至对照组的（53.6±7.1）%,3TC组减少至对照组的（34.6±8.2）%。同时,与对照组相比,ND4基因扩增显示,mtDNA主环拷贝数明显减低,D4T、AZT、3TC组分别为对照组的（25.2±7.3）%、（46.3±9.1）%和（42.3±7.4）%。与对照组比较,差异均有统计学意义（P﹤0.05）。但是,3组ND1基因扩增显示,mtDNA小环拷贝数依次为对照组的（67.7±5.2）%、（53.5±9.2）%和（94.4±8.3）%。AZT与对照组比较,mtDNA小环拷贝数明显降低（P﹤0.05）,其他两组与对照组比较则无明显变化。结论长期使用核苷类似物可产生小鼠神经元mtDNA损伤,且以主环缺失为主。     

单核细胞病毒库在HIV相关痴呆症发病机制中的作用

尽管联合抗病毒治疗,HIV仍能在淋巴细胞和单核细胞中持续存在.而且,即使体外研究证实HIV病毒颗粒nef、gp120和tat具有神经毒性,HIV相关痴呆症(HAD)的发生主要还是由于单核/巨噬细胞及与其相关的胶质细胞的间接免疫应答.因此,外周病毒库的循环单核细胞中的HIV在HAD发病机制中发挥着重要作用.针对循环单核细胞中HIV的导向治疗不仅有利于消灭外周病毒库,也有利于HAD及其他HIV并发症的防治.此文就单核细胞病毒库与HAD发病之间的关系进行了综述.     

HIV-1感染者中枢神经系统的病毒学特征研究

目的 探讨HIV-1感染者中枢神经系统(CNS)的病毒学特征.方法 通过克隆测序分析病毒亚型,观察CNS中HIV-1变异性和离散率;依据V3环11/25法则并结合10例有偿献血HIV-1感染者尸检脑组织标本免疫荧光试验分析中枢神经HIV-1复合受体的使用.结果 有偿献血人群感染的HIV-1显示B和B’亚型特征,脑脊液(CSF)和外周血序列有嵌合现象;CSF C2-V5区序列变异性明显低于外周血,两者的离散率差异无统计学意义;依据11/25法则分析V3环序列可见中枢神经HIV-1大多数使用CCR5复合受体.结论 CNS HIV-1病毒变异性明显小于外周血;CNS HIV-1具有CCR5嗜性.     

乙型肝炎病毒复制表达载体的构建与表达

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)复制表达载体,验证其在HepG2细胞系中的复制和表达。方法通过引物设计合成,以实验室构建的HBV C1亚型质粒通过PCR、酶切、克隆等分子生物学技术,构建HBV复制表达载体。利用转染试剂(Fugene HD Transfection Reagent)将载体质粒导入HepG2细胞,分别检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和HBV DNA在不同时间点的表达。结果酶切和测序结果均证实载体构建成功,通过瞬时转染细胞证实培养上清液中可检测到HBsAg、HBeAg和HBV DNA。结论利用分子克隆技术成功构建了HBV复制表达载体,可以在HepG2细胞系中复制表达。通过进一步改造,可以为HBV表型耐药以及复制活性研究提供支持。     

成像流式细胞仪检测细胞自噬水平研究

目的采用新型成像流式细胞仪量化检测细胞自噬水平,完善自噬检测手段。方法用绿色荧光蛋白(GFP)-微管相关蛋白轻链3(LC3)表达质粒转染Huh7细胞和H1299细胞,并进行24h饥饿处理,诱导自噬发生,分别用荧光显微镜拍照、蛋白免疫印迹法和成像流式细胞术3种方法检测细胞自噬水平。用IDEAS软件对成像流式细胞术的细胞自噬结果进行量化分析。结果荧光显微镜显示,Huh7细胞比H1299细胞中的自噬斑点少;蛋白免疫印迹法显示,与H1299细胞比较,Huh7细胞LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比例较低,但2种方法均不能获得通量统计数据。成像流式细胞仪结果显示细胞自噬图像,2种细胞的GFP-LC3质粒转染效率基本一致(25.2%和27.6%);比较两者发生高水平自噬(LC3斑点数目为6个以上)的细胞比例,Huh7细胞仅为9.0%,显著少于H1299细胞(26.2%)。结论采用新型成像流式细胞仪检测细胞自噬,兼具量化分析和成像的优点,能弥补荧光显微镜和蛋白免疫印迹法的不足,是一种更优秀的自噬检测方法。