人骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨人骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性,为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源。方法:无菌取成人髂骨骨髓,密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞(bonemarrowstroualcells,BMSCs);在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导为神经元样细胞,通过免疫细胞化学方法对诱导后细胞进行鉴定;通过高效液相色谱法(HPLC)检测诱导后细胞合成分泌神经递质去甲肾上腺素(NE)的能力。结果:分离得到的成人BMSCs培养10～14d后,细胞呈半贴壁状,胞体饱满,Nestin抗原染色阳性。培养20d后,在诱导因子作用下进一步分化为神经元样细胞(NLCs),具有细长双极或多极突起,神经核蛋白(NeuN)抗原表达阳性。HPLC检测BMSCs、空白神经干细胞培养液未测到NE,经体外诱导培养8,11d的神经干细胞、体外诱导分化20d的NLCs均可检测到NE,神经干细胞(8,11d)的NE含量为(10.4146±1.0425),(28.3359±3.8371)μg/L小于NLCs(20d)组(52.1342±3.9136)μg/L,差异有非常显著性意义(F=126.64,P=0.0000)。而且随着BMSCs培养天数的增加,其所含的NE浓度也渐增加(P<0.05)。结论:在适宜培养条件及诱导因子联合作用下,人BMSCs可被成功诱导为神经细胞,并具有合成分泌神经递质成分的能力。     

神经移植的种子细胞：大鼠骨髓基质细胞部分生物学特性

目的：分离培养SD大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cebls，BMSCs)，观察BMSCs部分生物学特性。方法：实验于2004—03／08在珠江医院广东省神经医学研究所实验室进行。采用密度梯度离心法分离BMSCs，MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞生长周期、鉴定细胞表面标志，免疫荧光染色观察细胞的神经分化功能及端粒酶反转录酶(TERP)表达。PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性。结果：①采用密度梯度离心法可以得到高纯度的BMSCs，表达CD29，CD44等表面标志，而不表达CD3l，CD34，CD45。②BMSCs主要由Ⅰ，Ⅱ型两种形态的细胞组成，其中Ⅱ型细胞表达端粒酶活性并可以诱导分化为Nestin阳性细胞。③骨髓基质细胞原代培养时增殖能力较低。结论：BMSCs主要有两种形态和功能不完全相同的细胞类型组成，其中Ⅱ型细胞具有端粒酶活性，并在一定的诱导条件下可以分化为Nestin阳性细胞，可以考虑作为神经移植的种子细胞来源。     

兔骨髓源性神经干细胞分化为成熟神经元样细胞的特征研究

目的：探讨兔骨髓源性神经干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)经体外培养及诱导分化成的神经元样细胞，能否合成分泌5-羟色胺神经生物活性物质成分。方法：分离兔BMSCs，应用神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化，免疫细胞化学鉴定；并应用高效液相色谱法(HPLC)检测其5-羟色胺生物活性物质的含量。细胞培养所涉及的细胞因子主要有脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸。结果：BMSCs培养12d可见大而圆细胞，免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性；培养20d可见长突起神经元样细胞，神经核蛋白(NeuN)免疫细胞化学检查阳性，高效液相检测BMSCs、空白神经干细胞培养液及L-02肝细胞阴性对照组未测到5-羟色胺生物活性物质，经体外培养增殖14d的神经干细胞及培养液、体外诱导分化20d的神经元样细胞及培养液则可检测到5-羟色胺分别为：每1&;#215;10^7细胞中(1．7940&;#177;0．0095)，(4．010&;#177;0．1170)μg／L，差异有非常显著性意义(t=30．6323，P=0．001)。方差分析显示：随着骨髓基质细胞培养天数的增加，其所含的5-羟色胺浓度也渐增加，组间5-羟色胺含量差异有显著意义(P＜0．01)。结论：兔BMSCs能在体外增殖，并表达Nestin抗原；而且，在适宜条件下能分化成神经元样细胞，并表达成熟神经元特异性核蛋白，合成、分泌5-羟色胺神经递质。     

利用菲立磁细胞内标记恒河猴骨髓基质细胞的初步实验

目的：探索利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记恒河猴骨髓基质细胞的可行性，为临床上应用磁共振成像追踪标记细胞奠定基础。方法：实验于2004—04／2005—05在南方医科大学珠江医院全军神经医学研究所完成。纳入健康恒河猴3只，无菌条件下取骨髓，梯度密度离心法分离获取恒河猴骨髓基质细胞，使用“菲立磁-多聚赖氨酸复合物”标记骨髓基质细胞，采用普鲁士兰染色、电镜和锥虫蓝排除实验等方法鉴定菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记恒河猴骨髓基质细胞的效率和细胞的活力，并对菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估。结果：①菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞，标记效率在99％左右。②普鲁士蓝染色显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。③电镜结果显示菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记的骨髓基质细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。④与正常未标记的细胞相比较，菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的影响。结论：菲立磁可以用来体外标记恒河猴骨髓基质细胞。     

脑胶质瘤干细胞鉴定与增殖及耐药特性的实验研究

目的 从胶质瘤组织中分离和培养出肿瘤干细胞,并初步探讨其生长特性. 方法 收集脑胶质瘤手术标本并获取细胞,用含有表皮生长因子(EGF)、白血病细胞抑制因子(LIE)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养液原代培养,再经免疫磁珠分离得到CD133+细胞.并用免疫细胞化学技术检测CD133、NSE和GFAP在细胞中的表达以鉴定CD133+细胞,比较不同恶性级别胶质瘤组织的CD133+细胞生长情况,并用CCK8法比较CD133+和CD133-细胞对替尼泊苷(VM-26)的耐药性. 结果 从胶质瘤组织中成功分选获得CD133+细胞,这些细胞能自我更新,增殖,并分化成NSE+和GFAP+的细胞.恶性度高的胶质瘤组织中CD133+细胞生长速度明显比低级别中的CD133+细胞快,且CD133+细胞在含有VM-26培养基中的存活细胞数显著多于CD133-细胞(P＜0.05). 结论 胶质瘤组织中存在肿瘤干细胞,这类细胞具有很强的耐药性,高恶性度胶质瘤组织中的CD133+细胞具有更强的增殖能力.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经元样细胞

目的 研究绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓基质细胞(GFP-GM-BMSCs)在体外无血清培养基+神经细胞因子诱导条件下,向神经细胞分化的能力。方法 用贴壁法体外培养GFP-GM-BMSCs,取第3代GFP-GM-BMSCs,用含浓度均为20μg/L的表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的无血清培养基（neurobasal-A+2%B27）诱导分化。第5天用免疫细胞荧光方法检测巢蛋白(nestin)的表达,第10天用神经元烯醇化酶 (NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学方法鉴定阳性细胞。结果 GFP-GM-BMSCs经无血清培养基+神经细胞因子诱导后,细胞胞体变圆,伸出细长突起, 有的突起连接成网,呈神经元样形态。诱导第5天,nestin阳性表达的细胞为40.24%+5.09%;第10天,NSE阳性、GFAP阳性的细胞分别为36.43%+5.27%和49.73%+6.28%。 结论 GFP-GM-BMSCs在体外含EGF、bFGF的无血清培养基中,能分化成神经元样细胞。     

Up-regulation of the transient A – type K+ current (IA) in the differentiation of neural stem cells of the early postnatal rat hippocampus

Background Neural stem cells (NSCs) not only are essential to cell replacement therapy and transplantation in clinical settings, but also provide a unique model for the research into neurogenesis and epigenesis. However, little attention has been paid to the electrophysiological characterization of NSC development. This work aimed to identify that whether the morphological neuronal differentiation process in NSCs included changes in the electrophysiological properties of transient A-type K+ currents (IA). Methods NSCs were isolated from early postnatal rat hippocampus and were multiplied in basic serum-free medium containing basic fibroblast growth factor. Potassium currents were investigated using whole-cell patch-clamp techniques. Results Compared to NSC-derived neurons, cNSCs (cloned NSCs) had a more positive resting membrane potential, a higher input resistance, and a lower membrane capacitance. Part of cNSCs and NSC-derived neurons possessed both delayed-rectifier K+ currents (IDR) and IA, Steady-state activation of IA in cNSCs (half-maximal activation at 21.34±4.37 mV) occurred at a more positive voltage than in NSC-derived neurons at 0–6 days in vitro (half-maximal activation at 12.85±4.19 mV). Conclusions Our research revealed a developmental up-regulation of the IA component during differentiation of postnatal NSCs. Together with the marked developmental up-regulation of IDR in vitro neuronal differentiation we have previously found, suggest that the voltage-gated potassium channels may participate in neuronal maturation process.     

编码轴突生长抑制因子的重组DNA疫苗的免疫原性研究

目的 探讨以前期实验所构建的腺病毒骨架质粒pAdEasy为载体,编码神经损伤后轴突生长抑制因子Nogo-A、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)、腱糖蛋白-R(TN-R)和髓磷脂相关糖蛋白(MAG)的重组DNA疫苗的免疫原性. 方法 16只5周龄Lewis大鼠按随机数字表法分为DNA疫苗注射组(Vaccine组)和空质粒注射组(pAdEasy组).Vaccine组大鼠以DNA疫苗经双侧胫骨肌注射免疫,1次/周,共持续8周.每次进行疫苗注射前采血和分离血清,Dot-blot和ELISA法对血清中抗体进行定性和定量检测. 结果 6周后Vaccine组大鼠血清能与GST-TN-R和GST-OMgp融合蛋白产生较强的免疫反应,点杂交反应较明显;pAdEasy组大鼠血清则不能与GST-TN-R和GST-OMgp融合蛋白产生免疫反应.6周后Vaccine组大鼠血清中抗体效价则可以达到1:100万,并保持稳定的水平. 结论 编码轴突生长抑制因子Nogo-A、OMgp、TN-R和MAG的重组DNA疫苗接种大鼠后能够产生特异性的抗体.说明该重组DNA疫苗具有良好的免疫原性.     

不同年龄大鼠组织端粒酶活性变化的研究

目的 了解不同组织端粒酶活性随年龄变化的规律，为治疗性克隆核供体细胞的选择提供依据。方法 采用PCR-ELISA法检测不同年龄SD大鼠皮肤、肌肉、骨髓、脑和睾丸组织的端粒酶活性。结果 (1)随着年龄的增长，各组织端粒酶活性均呈下降趋势；(2)新生皮肤、肌肉和脑组织表达端粒酶活性，一月后则不再表达端粒酶活性；(3)一月至二年骨髓和睾丸组织均保持较高端粒酶活性。结论 端粒酶活性表达程度与不同组织有关，骨髓和睾丸组织能维持较高端粒酶活性；骨髓组织中持续表达端粒酶活性的细胞可能足一种较好的核供体细胞。     

食蟹猴骨髓基质干细胞体外诱导分化的实验研究

为观察食蟹猴骨髓基质干细胞（BMSC）体外培养及诱导分化情况，分离食蟹猴的BMSC，以神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化。结果发现，分离得到的食蟹猴BMSC能在体外培养中增殖，分化，这些具有克隆能力的BMSC能表达神经干细胞特异性抗原Nestin，并能进一步诱导分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有GFAP和NSE抗原表达。提示灵长类BMSC是多分化潜能细胞，具有较强的自我更新和多分化能力，在适当的诱导分化条件下可形成具有神经系细胞（神经元和神经胶质细胞）特征的细胞；BMSC可作为神经干细胞的种子细胞。