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1.
目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路. 相似文献
2.
目的:利用基因工程技术对 par-4 SAC 进行基因克隆并测定其序列,为进一步诱导肿瘤细胞靶向性凋亡的基因治疗奠定基础.方法:采用非对称互补引物/模板法,制备两端含有酶切位点的 par-4 SAC 的 cDNA,PCR产物克隆入 pGEM-T Easy 载体并转化感受态大肠杆菌 E.coli DH5α菌株,随机挑取数个菌落,筛选鉴定并测序.结果:经酶切鉴定、测序分析,表明所插入的基因片断为 par-4 SAC 基因,与设计完全相同.结论:应用非对称互补引物/模板法克隆 par-4 SAC 基因是成功及可行的. 相似文献
3.
目的:包装携载神经营养素(NT4)与活性依赖性神经营养因子-9(ADNF-9)融合基因的重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9,并观察该重组病毒对体外培养的耳蜗组织的转染。方法:使用pSSHG-CMV-NT4-ADNF-9,pGF140和pAAV/Ad 3种质粒共转染293包装细胞,制备ADNF-9重组腺相关病毒(recomb inate adeno-assoc iated virus,rAAV),应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度;体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞;将重组病毒感染体外培养的新生SD大鼠耳蜗毛细胞,于24 h后提取组织行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以检测rAAV-NT4-ADNF-9对耳蜗的转染。结果:应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度为2×1013cfu/m l,表明成功地构建了重组AAV载体。成功分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞后,经RT-PCR反应,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在耳蜗组织得到了表达。结论:构建的重组病毒rAAV-NT4-ADNF-9,在体外可成功转染耳蜗组织,用于基因治疗的研究。 相似文献
4.
目的:利用基因工程技术构建人骨形态发生蛋白2重组腺病毒,并进行体内表达,测定活性;为深入开展的基因治疗研究创造条件。方法:实验于2000-05/2002-06在西安交通大学第一附属医院骨科实验室完成。应用PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白2全长基因,体外同源重组构建重组腺病毒后,随机将30只SD大鼠分为治疗组和对照组,每组15只,将纯化后的重组腺病毒50μL注入SD大鼠股部肌肉陷窝病损处,通过组织学染色、X射线片对动物模型的组织变化进行观测。结果:6周后治疗组可见明显骨诱导形成,2周时治疗组碱性磷酸酶活性明显高于对照组,重组腺病毒治疗组有明显的诱导成骨活性。结论:应用于动物实验中目的基因表达,并具有生物学活性。本研究是在骨缺损基因治疗的一次尝试,且人骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功,也为国内骨科疾病基因治疗的进一步研究提供了基础。 相似文献
5.
腺病毒介导的NT4p53(N15)Ant异源融合基因对肝癌细胞的杀伤作用 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 构建包括神经营养因子4(NT4)信号肽,p53氨基端短活性肽(12~26位氨基酸)及蛋白质转导结构域-黑腹果蝇触足肽(Ant)序列在内的异源融合基因,并以腺病毒作为基因转移载体观察NT4p53(N15)Ant基因在体外对肝癌细胞系HepG2的杀伤效应.方法 应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法获得p53(N15)Ant基因克隆,经酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4p53(N15)Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pJM17共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒,经PCR鉴定后,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒感染HepG2细胞,用MTT比色法和PI染色流式细胞计数仪分析Ad.NT4p53(N15)Ant对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤效应及凋亡率.结果 克隆出NT4p53(N15)Ant基因,得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA经PCR证实含目的基因.MTT测定结果显示,与平行对照病毒Ad.GFP相比,Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,且以病毒感染后48 h作用最为明显,对肿瘤细胞抑制率达到63.3%,而对正常细胞NIH3T3的影响很小.Ad.NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞30 h后的流式细胞仪分析结果显示:Ad.NT4p53(N15)Ant可使HepG2细胞发生凋亡,凋亡率为18.16%.结论 通过分子克隆体外重组技术我们首次成功制备了NT4p53(N15)Ant复制缺陷型重组腺病毒;初步的研究发现Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,这种效应部分是通过诱导HepG2细胞的凋亡而实现的. 相似文献
6.
目的 构建NT4-p53(N37)-HA2-TAT融合基因表达盒并进行序列分析. 方法 应用互补引物二次PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N37)基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序.扩增阳性重组质粒后用限制性内切酶切取p53(N37)和HA2-TAT片段连入pUC19/NT4质粒. 结果 克隆了p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pUC19/NT4-p53(N37)-HA2-TAT经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果显示酶切片段大小和理论值完全一致. 结论 通过基因克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N37)-HA2-TAT表达盒的pUC/19质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础. 相似文献
7.
靶向人端粒酶逆转录酶进行RNAi的逆转录病毒载体的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
目的构建靶向性干扰人端粒酶逆转录酶表达的特异性小干扰RNA的真核表达载体。方法采用PCR法分别扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列、U6启动子序列和靶向性干扰人端粒酶逆转录酶的特异性小干扰RNA对应的DNA序列,随后将与之相应的DNA序列片断依次克隆入真核表达载体pLXSN中,并通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体进行鉴定。以荧光显微镜和利用流式细胞仪分析重组病毒表达EGFP蛋白的情况。以MTT方法检测初步分析重组病毒对人Hela细胞的RNAi效果。结果限制性内切酶酶切和测序结果均表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶的小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT。以磷酸钙共转染法制备的重组逆转录病毒滴定了病毒滴度后,重组病毒感染人Hela细胞24h时用流式细胞仪测得EGFP表达的阳性率为24.1%。重组逆转录病毒感染人Hela细胞48h时,MTT实验测得细胞死亡率为53.2%。结论成功构建了针对人端粒酶逆转录酶小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT,并制备了重组逆转录病毒,初步观察了效应,为进一步利用小干扰RNA技术研究肿瘤的基因治疗奠定了基础。 相似文献
8.
目的 :探讨PEI作为免疫佐剂对G250抗原肽基因PVAX1/C-G250肽-C免疫保护效果的增强作用及联合应用CAIX蛋白疫苗进行PRIME—BOOST免疫程序免疫增强效果。方法:用Eco R I、Xho I和Eco R I、Sal I分别双酶切PVAX1及既往构建的p ET28a(+)/C-G250肽-C质粒。利用DNA重组技术构建重组质粒PVAX1/C-G250肽-C,酶切分析鉴定。大量提取质粒并分光光度计测质粒含量。将32只雌性昆明小鼠随机分为(A)裸DNA组,(B)DNA-PEI复合物组,(C)DNA-PEI+蛋白疫苗组,(D)空白对照组。按0,10,20,30天程序经股四头肌注射免疫。C组在第20天及第30天进行蛋白冲击。初次免疫前和第40天鼠尾取血,ELISA法检测抗体滴度。流式细胞术测淋巴细胞亚群CD4+和CD8+。结果:酶切及基因测序鉴定证实G250抗原肽c DNA正确插入PVAX1/C-G250肽-C真核表达的重组质粒中。昆明小鼠经4次免疫后,3个实验组都产生了特异性的体液和细胞免疫反应,B组的抗体滴度1:1.28×104及CD4+、CD8+达26.12%和12.60%,明显高于A组的1:3.2×103和CD4+,CD8+占到19.32%和10.74%。而蛋白冲击组的1:5.12×104和CD4+,CD8+占到41.96%和15.14%,明显高于B组(P0.05)。结论:成功构建重组质粒PVAX1/C-G250肽-C。该DNA疫苗与PEI和G250蛋白疫苗联合使用后产生极强的免疫原性,诱导产生了高滴度、高特异性抗体及细胞免疫反应。证实G250DNA疫苗联合PEI使用并进行蛋白疫苗冲击的免疫策略可产生强大的免疫保护作用。为恶性肿瘤的术后辅助治疗提供新的思路和方法。 相似文献
9.
目的:通过滴鼻给药途径,给予闭合性脑损伤小鼠可分泌表达神经保护肽NAP的重组慢病毒,观察该重组病毒经鼻-脑通路对中枢神经系统的保护作用,为携带可分泌表达NAP的重组慢病毒治疗神经系统退行性疾病提供理论依据。 方法:选用8~12周成年雄性昆明小鼠54只,随机分为4组:空白对照组10只(Control组)、重锤加害组20只(CHI组)、重组慢病毒rLent/NT4-NAP保护组20只(rLent组)和重组慢病毒rLent/GFP组4只(GFP组)。观察各组小鼠的死亡率、神经功能损伤(NSS)评分、脑水肿含量和病理改变情况。应用共聚焦显微镜观测GFP组小鼠鼻黏膜、嗅神经和脑组织内绿色荧光表达情况。 结果:rLent组小鼠死亡率(15%)明显低于CHI组小鼠(55%);rLent组小鼠NSS评分在创伤后1、3、5和7 d均显著低于CHI组(P<0.01); rLent组小鼠创伤后24 h的脑水肿含量明显低于CHI组(P<0.01);HE染色显示rLent组小鼠病理改变明显轻于CHI组;GFP组仅在鼻黏膜处可见呈条索样的绿色荧光,而在嗅神经及大脑则未发现绿色荧光。 结论:分泌表达NAP的重组慢病毒可感染鼻黏膜细胞,分泌表达的短肽NAP能够改善闭合性脑损伤小鼠的神经功能;未加装分泌表达元件的重组病毒rLent/GFP仅能感染鼻黏膜细胞,不能通过血脑屏障进入中枢神经系统。 相似文献
10.
392例HBsAg阳性急慢性肝炎和携带者血清δ系统的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
本文应用国产丁型肝炎病毒(HDV)酶联免疫试剂对392份HBsAg阳性肝炎和携带者血清进行了抗-HD、抗-HDIgM和HDAg测定,HDV总感染率为10.7%(42/392)。其中以重型肝炎组HDV标志检出率最高,达27.8%,然后依次为慢性肝病(15.5%)和急性乙肝(5.3%),HBsAg阳性携带者无1例阳性。本研究资料提示HDV感染对HBV感染在加重肝损害、促进肝脏炎症进展及慢性化方面均起十分重要作用。HDV标志与HDV RNA的测定亦有较高的符合率(96.9%)。 相似文献