成鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

目的:探讨成鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的可行性。方法:实验于2004-06/2005-06在中国医科大学实验动物中心完成,选取Wistar大鼠40只,4只用于骨髓间充质干细胞的培养;细胞移植组12只,磷酸盐缓冲液组12只,空白对照组12只。首先分离、培养及通过免疫细胞化学方法鉴定骨髓间充质干细胞,传代后经5溴脱氧尿嘧啶标记,采用局部注射的方法移植于Wistar大鼠脊髓全横断损伤区,移植后第7,14,28天通过免疫组化方法检测标记的移植细胞是否存活,并通过辣根过氧化物酶示踪技术检测损伤区域的轴突是否再生。结果:①原代骨髓间充质干细胞呈圆形,迅速贴壁,伸展,重新变为梭形或扁平型细胞。②免疫细胞化学染色显示骨髓间充质干细胞表面抗原CD45呈阴性表达,CD90呈阳性表达。③成鼠骨髓间充质干细胞可由5溴脱氧尿嘧啶成功进行核标记,在采取局部注射的办法移植到损坏脊髓区域后可以检测到移植的细胞存活,光镜下5溴脱氧尿嘧啶标记的细胞呈棕黄色,以损伤区域为中心逐渐向头尾端迁移。④辣根过氧化物酶阳性反应物定位于神经元的胞浆,呈棕黄色颗粒,提示脊髓损伤处存在着轴浆运输以及轴突的再生,与对照组比较差别具有统计学意义。结论:骨髓间充质干细胞在移植后可存活于脊髓损伤区,并且促进轴突的再生。     

脊髓损伤大鼠组织形态学变化与不同时点的Netrin-1表达

目的:Netrin-1蛋白可能具有轴突引导作用,观察其在大鼠急性脊髓损伤后不同时点的表达及损伤脊髓组织形态学的变化.方法:实验于2002-10/2003-10在中国医科大学实验动物中心完成,选取Wistar大鼠40只,随机分为损伤组20只,假手术组15只,正常对照组5只.制作大鼠脊髓半横断损伤模型,并于术后1,3,5,7,14 d分别选择损伤组大鼠4只,假手术组3只,正常对照组1只,麻醉下取出T10节段脊髓经过处理制成切片,行苏木精-伊红染色观察损伤脊髓组织形态改变.经苏木精-伊红染色和常规卵白素-生物素-过氧化物酶复合物染色,电镜检测Netrin-1阳性反应物的表达.各组每只分别选取9张组化切片,分别从灰质前角至后角取8个高倍镜视野,测定其阳性反应物的平均灰度值,通过对平均灰度值的分析,测定Netrin-1的表达量.结果:在整个实验过程中,40只大鼠无死亡.实验切片360张,所取视野的平均灰度值均达到统计学分析要求.①3组苏木精-伊红染色组织形态学改变:假手术组与正常对照组脊髓均为正常结构.损伤组脊髓损伤后第1天灰质内出现片状出血、中央区碎裂,轴突断裂及脱髓鞘改变;第3天神经元肿胀,逐渐形成空洞,胶质细胞减少;第5,7天残存神经元减少,胶质细胞增生;第14天神经元胞浆内尼氏体染色呈虎斑状,提示生理功能逐渐恢复②3组Netrin-1表达:损伤组大鼠脊髓损伤后第1天于胶质细胞上可检测到Netrin-1的表达,第3天在神经元胞质内出现,表达逐渐升高,第5天表达量较假手术组增加26.3%,组间有差异x^2=0.023,P＜0.05.第7天达到高峰并趋于稳定,第14天开始逐渐下降.正常对照组仅少量表达,假手术组与正常组之间差异比较P＞0.05.结论:在脊髓损伤后轴突导向分子Netrin-1呈一过性表达,其表达变化与苏木精-伊红染色损伤组脊髓修复程度均具有时序性.     

低温保存神经干细胞复苏后移植对脊髓损伤大鼠轴突再生的影响：逆行示踪标记观察**★

目的：关于神经干细胞移植治疗脊髓损伤的研究已有一些报道，对细胞移植的时间、方式以及检测的指标各有不同观点。实验观察了低温保存的神经干细胞复苏后移植对大鼠脊髓损伤后轴突再生的影响。 方法：实验于2005-06/2006-06在中国医科大学实验动物中心完成。①实验材料：选取Wistar成年大鼠36只，雌雄不限，体质量250~300 g，由中国医科大学实验动物部提供。新生大鼠10只，用作神经干细胞的分离与培养。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：将获得的神经干细胞在处于对数生长期阶段-70 ℃冻存2周，复温后用5-溴脱氧尿嘧啶核苷法标记。制备大鼠脊髓损伤模型，伤后立即进行移植干预，实验分为3组：神经干细胞移植组、DMEM培养液填充组、空白对照组。③实验评估：应用免疫组织化学法观察移植细胞存活及迁移情况，行辣根过氧化物酶逆行示踪法观察脊髓损伤处轴浆运输的重建。 结果：36只脊髓横断损伤模型因麻醉过量死亡4只，感染死亡5只，予补足。复苏的神经干细胞经Brdu核标记后移植到脊髓损伤区，在损伤脊髓区域可检测到标记的阳性细胞。第7天可见，第14天增多，第28天逐渐减少并消失。辣根示踪技术显示神经干细胞移植组较DMEM培养液填充组阳性细胞明显增多，组间差异有统计学意义。 结论：低温保存的神经干细胞移植到脊髓损伤区域后可存活，并参与脊髓损伤处轴浆通路的结构重建。     

生长相关蛋白在脊髓源性神经干细胞向神经主细胞分化过程中的表达

目的:探讨脊髓源性神经干细胞向神经元诱导分化过程中生长相关蛋白43的表达,分析其对脊髓损伤修复的主导作用。方法:实验于2003-03/09在中国医科大学实验动物中心完成。取15只孕14d的胎鼠,自胎鼠的脊髓区提取神经干细胞,经培养及神经巢蛋白免疫细胞化学鉴定,观察在神经干细胞定向诱导分化为神经元过程中,生长相关蛋白43于不同时间点的形态学表达。培养液为添加B27(2%)、碱性成纤维细胞生长因子(20mg/L)、表皮细胞生长因子(20mg/L)的无血清培养基DMEM/F12。置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中悬浮培养,观察其生长情况,每3天换液1次,共培养5次。分别于分化1,2,4,8d取出载玻片,对生长相关蛋白的表达进行免疫组化检测。总细胞和阳性细胞在显微镜下计数。结果:15只胎鼠的脊髓源性神经干细胞全部进入结果分析。①神经干细胞的培养情况:培养24h后,可见神经球;第2天时,神经球数目增多,呈桑椹状,折光性强,死细胞无光泽,仅有轮廓。②神经干细胞的鉴定结果:免疫细胞化学染色可见神经球内圆形细胞呈神经巢蛋白抗原强阳性,核未着色。神经干细胞定向分化后,细胞逐渐贴壁,到第4,8天时,细胞逐渐变大,突起变长,偶见多个突起。神经元特异性烯醇化酶阳性的神经元,胞浆及核膜出现棕色阳性反应,细胞核大而圆,无着色。细胞连续计数共712个,其中神经元特异性烯醇化酶阳性细胞296个,比例为41.57%。③神经干细胞分化过程中生长相关蛋白表达的测定:神经干细胞分化第1天,胞质内出现生长相关蛋白,第4天表达增强,于核周及突起中明显,逐渐向胞膜转移,并且长的突起与其他细胞的突起之间形成连接,至分化第8天时这种突起生长停止,神经干细胞分化为成熟的神经元细胞,生长相关蛋白反应减弱并消失。细胞连续计数共736个,其中生长相关蛋白阳性细胞246个,比例为33.42%。结论:在神经干细胞分化为神经元的过程中,生长相关蛋白基因呈一过性表达,参与引导突起的生长并发挥促进作用。     

成鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

目的：探讨成鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的可行性。 方法：实验于2004-06／2005-06在中国医科大学实验动物中心完成，选取Wistar大鼠40只，4只用于骨髓间充质干细胞的培养；细胞移植组12只，磷酸盐缓冲液组12只，空白对照组12只。首先分离、培养及通过免疫细胞化学方法鉴定骨髓间充质干细胞，传代后经5溴脱氧尿嘧啶标记，采用局部注射的方法移植于Wistar大鼠脊髓全横断损伤区，移植后第7，14，28天通过免疫组化方法检测标记的移植细胞是否存活。并通过辣根过氧化物酶示踪技术检测损伤区域的轴突是否再生。 结果：①原代骨髓间充质干细胞呈圆形，迅速贴壁，伸展，重新变为梭形或扁平型细胞。②免疫细胞化学染色显示骨髓间充质干细胞表面抗原CD45呈阴性表达，CD90呈阳性表达。③成鼠骨髓间充质干细胞可由5溴脱氧尿嘧啶成功进行核标记，在采取局部注射的办法移植到损坏脊髓区域后可以检测到移植的细胞存活，光镜下5溴脱氧尿嘧啶标记的细胞呈棕黄色，以损伤区域为中心逐渐向头尾端迁移。④辣根过氧化物酶阳性反应物定位于神经元的胞浆，呈棕黄色颗粒，提示脊髓损伤处存在着轴浆运输以及轴突的再生，与对照组比较差别具有统计学意义。 结论：骨髓间充质干细胞在移植后可存活于脊髓损伤区，并且促进轴突的再生。     

低温保存神经干细胞复苏后移植对脊髓损伤大鼠轴突再生的影响:逆行示踪标记观察

目的:关于神经干细胞移植治疗脊髓损伤的研究己有一些报道,对细胞移植的时间、方式以及检测的指标各有不同观点.实验观察了低温保存的神经干细胞复苏后移植对大鼠脊髓损伤后轴突再生的影响.方法:实验于2005-0612006-06在中国医科大学实验动物中心完成.①实验材料:选取Wistar成年大鼠36只,雌雄不限,体质量250～300g,由中国医科大学实验动物部提供.新生大鼠10只,用作神经干细胞的分离与培养.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:将获得的神经干细胞在处于对数生长期阶段-70℃冻存2周,复温后用5-溴脱氧尿嘧啶核苷法标记.制备大鼠脊髓损伤模型,伤后立即进行移植干预,实验分为3组:神经干细胞移植组、DMEM培养液填充组、空白对照组.③实验评估:应用免疫组织化学法观察移植细胞存活及迁移情况,行辣根过氧化物酶逆行示踪法观察脊髓损伤处轴浆运输的重建.结果:36只脊髓横断损伤模型因麻醉过最死亡4只,感染死亡5只,予补足.复苏的神经干细胞经Brdu核标记后移植到脊髓损伤区,在损伤脊髓区域可检测到标记的阳性细胞.第7天可见,第14天增多,第28天逐渐减少并消失.辣根示踪技术显示神经干细胞移植组较DMEM培养液填充组阳性细胞明显增多,组间差异有统计学意义.结论:低温保存的神经干细胞移植到脊髓损伤区域后可存活,并参与脊髓损伤处轴浆通路的结构重建.     

脊髓损伤大鼠组织形态学变化与不同时点的Netrin-1表达

目的:Netrin-1蛋白可能具有轴突引导作用,观察其在大鼠急性脊髓损伤后不同时点的表达及损伤脊髓组织形态学的变化。方法:实验于2002-10/2003-10在中国医科大学实验动物中心完成,选取Wistar大鼠40只,随机分为损伤组20只,假手术组15只,正常对照组5只。制作大鼠脊髓半横断损伤模型,并于术后1,3,5,7,14d分别选择损伤组大鼠4只,假手术组3只,正常对照组1只,麻醉下取出T10节段脊髓经过处理制成切片,行苏木精-伊红染色观察损伤脊髓组织形态改变。经苏木精-伊红染色和常规卵白素-生物素-过氧化物酶复合物染色,电镜检测Netrin-1阳性反应物的表达。各组每只分别选取9张组化切片,分别从灰质前角至后角取8个高倍镜视野,测定其阳性反应物的平均灰度值,通过对平均灰度值的分析,测定Netrin-1的表达量。结果:在整个实验过程中,40只大鼠无死亡。实验切片360张,所取视野的平均灰度值均达到统计学分析要求。①3组苏木精-伊红染色组织形态学改变:假手术组与正常对照组脊髓均为正常结构。损伤组脊髓损伤后第1天灰质内出现片状出血、中央区碎裂,轴突断裂及脱髓鞘改变;第3天神经元肿胀,逐渐形成空洞,胶质细胞减少;第5,7天残存神经元减少,胶质细胞增生;第14天神经元胞浆内尼氏体染色呈虎斑状,提示生理功能逐渐恢复②3组Netrin-1表     

骨髓间充质干细胞移植后大鼠脊髓损伤处多唾液酸神经细胞黏附分子的表达

目的:观察骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤对多唾液酸神经细胞黏附分子表达的影响及意义。方法:实验于2004-06/2005-06在中国医科大学实验动物中心完成。随机选择4只大鼠作骨髓间充质细胞的分离与培养,骨髓间充质干细胞传4代后大约长至60%汇合时,吸弃培养基,加入5溴脱氧尿嘧啶标记培养基。36只大鼠分成3组制作脊髓横断损伤模型:骨髓间充质干细胞移植组、磷酸盐缓冲液组、空白对照组,每组12只。制作大鼠脊髓损伤模型,于伤后立即移植骨髓间充质干细胞。应用免疫组化法观察细胞移植后7,14,28d不同时间点移植细胞的存活情况,苏木精-伊红染色及常规链酶亲和素-生物素-过氧化酶复合物免疫组化法检测5溴脱氧尿嘧啶和多唾液酸神经细胞黏附分子的阳性细胞表达。结果:40只大鼠中36只制作脊髓横断损伤模型,6只因感染死亡,给予补足。①骨髓间充质干细胞移植组5溴脱氧尿嘧啶阳性细胞在移植后第7天可检测到,呈棕黄色的核标记,临近损伤区阳性细胞增多,在向头尾端迁移过程中阳性细胞逐渐减少,切片中可见最远迁移至距离损伤区1.5cm。磷酸盐缓冲液组及空白对照组均未见阳性细胞。②骨髓间充质干细胞移植组在移植术后第7天可于近端检测到多唾液酸神经细胞黏附分子阳性表达的细胞;磷酸盐缓冲液组可见少量阳性细胞;空白对照组未见阳性细胞。棕色颗粒定位于神经元的胞质和胞膜。移植术后第14天,骨髓间充质干细胞移植组脊髓切片的阳性神经细胞数开始增多,与磷酸盐缓冲液组比较,差异显著(16.0±2.6,6.0±2.3,P<0.05)。移植术后第28天,骨髓间充质干细胞移植组脊髓切片的阳性神经细胞逐渐减少。结论:骨髓间充质干细胞在移植后可明显促进多唾液酸神经细胞黏附分子的表达,是修复脊髓损伤并参与突触重建的重要机制。     

生长相关蛋白在脊髓源性神经干细胞向神经主细胞分化过程中的表达

目的：探讨脊髓源性神经干细胞向神经元诱导分化过程中生长相关蛋白43的表达，分析其对脊髓损伤修复的主导作用。方法：实验于2003-03／09在中国医科大学实验动物中心完成。取15只孕14d的胎鼠，自胎鼠的脊髓区提取神经干细胞，经培养及神经巢蛋白免疫细胞化学鉴定，观察在神经干细胞定向诱导分化为神经元过程中，生长相关蛋白43于不同时间点的形态学表达。培养液为添加B27(2％)、碱性成纤维细胞生长因子(20mg／L)、表皮细胞生长因子(20mg／L)的无血清培养基DMEM／F12。置于37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱中悬浮培养，观察其生长情况，每3天换液1次，共培养5次。分别于分化1，2，4，8d取出载玻片，对生长相关蛋白的表达进行免疫组化检测。总细胞和阳性细胞在显微镜下计数。结果：15只胎鼠的脊髓源性神经干细胞全部进入结果分析。①神经干细胞的培养情况：培养24h后，可见神经球；第2天时，神经球数目增多，呈桑椹状，折光性强，死细胞无光泽，仅有轮廓。②神经干细胞的鉴定结果：免疫细胞化学染色可见神经球内圆形细胞呈神经巢蛋白抗原强阳性，核未着色。神经干细胞定向分化后，细胞逐渐贴壁，到第4，8天时，细胞逐渐变大，突起变长，偶见多个突起。神经元特异性烯醇化酶阳性的神经元，胞浆及核膜出现棕色阳性反应，细胞核大而圆，无着色。细胞连续计数共712个，其中神经元特异性烯醇化酶阳性细胞296个，比例为41．57％。⑧神经干细胞分化过程中生长相关蛋白表达的测定：神经干细胞分化第1天，胞质内出现生长相关蛋白，第4天表达增强，于核周及突起中明显，逐渐向胞膜转移，并且长的突起与其他细胞的突起之间形成连接，至分化第8天时这种突起生长停止，神经干细胞分化为成熟的神经元细胞，生长相关蛋白反应减弱并消失。细胞连续计数共736个，其中生长相关蛋白阳性细胞246个，比例为33．42％。结论：在神经干细胞分化为神经元的过程中，生长相关蛋白基因呈一过性表达，参与引导突起的生长并发挥促进作用。     

铁法大隆矿煤工尘肺预防效果评价

目的评价40年来大隆矿煤工尘肺的预防效果,为进一步改善防尘降尘措施提供理论依据。方法采用"煤工尘肺调查表"和"接尘工人未患尘肺者调查表"对所有曾接尘的该矿工人进行个案调查,用单因素方差分析、寿命表法、Log-rank检验等统计学方法,分析了其中所有接尘工人的资料。结果大隆矿1959年前、1960～1964年、1965～1969年、1970～1979年不同年代接尘作业工人至2004年底尘肺累积发病率分别为:67.50%、15.07%、11.64%、0.00%,年平均发病率分别为:1.41%、0.36%、0.31%、0.00%。不同年代诊断的尘肺病人平均发病年龄与平均接尘工龄分别由80年代以前的40.94岁与16.11年,延长到80～90年代为49.04岁与22.04年,90年代进一步延长为63.30岁与27.70年。推行综合防尘措施后参加接尘作业矿工较之推行前,在相同观察周年内,累积发病率比较,差别有显著性(P<0.0001)。假设1980年后各年尘肺发病率与1980年前参加者相同,计算得预期发病人数为21人,而实际发病人数为0人。结论大隆矿煤工尘肺的发病情况逐渐减轻,1980年推行综合防尘降尘措施后发病情况减轻。