基于重组酶介导核酸等温扩增反应的曼氏血吸虫 基因检测方法的建立

目的　建立一种可用于曼氏血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法（Recombinase?aided amplification, RAA）。方法　以曼氏血吸虫121 bp高重复基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立并优化荧光RAA法反应体系。分别以不同拷贝数的含121 bp基因片段的重组质粒及不同浓度曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA法扩增,评价该方法的敏感性;分别以日本和埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,评价其特异性。结果　建立的荧光RAA法可在39 ℃、20 min内特异性扩增曼氏血吸虫基因组DNA。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/μL;以基因组DNA为模板,荧光RAA法最低可检测浓度为0.1 fg/μL。以日本血吸虫虫卵、埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于曼氏血吸虫DNA检测的荧光RAA法,该方法反应快捷、操作简便,敏感性和特异性均较好。     

重组酶介导的核酸等温扩增荧光法检测日本血吸虫感染性钉螺的效能评价

目的　评价重组酶介导的核酸等温扩增（recombinase?aided amplification,RAA）荧光法检测日本血吸虫感染性钉螺的效能。方法　采用群体法检测。每50只钉螺作为1个检测样本,阴性样本不含感染性钉螺,阳性样本含不同数量感染性钉螺。设置阴性样本10个和分别含有1、2、3只感染性钉螺的阳性样本各10个,40个样本随机分组后,以盲法经荧光RAA法检测,并以逸蚴法检测结果为金标准,计算荧光RAA法检测灵敏度、特异度、正确指数及符合率。设置阴性钉螺样本5个和分别含有1、2、3只感染性钉螺的阳性样本各5个,20个样本随机分组后,采用配对设计法对同一个样本以盲法分别经压碎镜检法和荧光RAA法进行检测并比较检测结果。 结果　荧光RAA法检测30个阳性样本,29个检测结果为阳性,灵敏度为96.67%;检测10个阴性样本,其中8个检测结果为阴性,特异度为80.00%;约登指数为0.77,同一样本重复检测10次符合率为100%。荧光RAA法与压碎镜检法检测感染性钉螺结果差异无统计学意义（[χ2] = 0,P > 0.05）,检测结果与实际符合率分别为95.00%（19/20）和90.00%（18/20）。结论　荧光RAA法对日本血吸虫感染性钉螺具有良好检测效能,在日本血吸虫感染性钉螺筛查中具有一定应用前景。     

尿液中外源日本血吸虫小分子DNA片段提取方法的建立与评价

目的　建立尿液中外源添加的日本血吸虫小分子DNA片段提取方法,评价不同方法处理尿液后的提取效果。方法　以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,通过PCR扩增靶序列上的81 bp小分子DNA片段,经测序鉴定后作为拟添加到尿液样本中的外源小分子DNA片段。以SjG28为靶基因设计引物及探针,建立实时荧光定量PCR（qPCR）方法;将外源小分子DNA片段以10为梯度倍比稀释后进行扩增,评价该方法的敏感性;以日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、巴贝虫、十二指肠钩口线虫、华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA为模板进行检测,评价该方法的特异性。将外源小分子DNA片段添加至人工尿液及健康人尿液后,经调整pH值、离心、浓缩等处理后,采用QIAmp Viral RNA Mini Kit （Qiagen试剂盒）、BIOG游离DNA 提取试剂盒（BIOG 试剂盒）提取尿液中的外源小分子DNA片段,比较不同处理方式及提取方法的效果。结果　成功制备81 bp外源日本血吸虫小分子DNA片段,建立的qPCR法最低能检测到100拷贝/μL的81 bp外源日本血吸虫小分子DNA片段。以上述7种寄生虫DNA为模板进行检测,仅日本血吸虫基因组DNA模板有荧光信号值增长。调整人工尿液pH值为5、6、7、8,采用Qiagen试剂盒提取其中的外源日本血吸虫小分子DNA片段回收率分别（49.12 ± 2.09）%、（84.52 ± 4.96）%、（89.38 ± 3.32）%和（87.82 ± 3.90）%;采用BIOG试剂盒提取小分子DNA片段回收率分别为（2.30 ± 0.07）%、（8.11 ± 0.26）%、（13.35 ± 0.61）%、（20.82 ± 0.68）%,两种方法提取回收率差异均有统计学意义（t = 38.702、26.955、39.042、29.571,P 均< 0.01）。采用Qiagen试剂盒提取人工尿液,pH值为5时核酸回收率最低（P均< 0.05）;pH值为6、7、8时,核酸回收率差异均无统计学意义（P均> 0.05）。人工尿液[（64.30 ± 1.00）% vs. （58.87 ± 0.26）%;t = 12.033,P < 0.05）]、健康人尿液[（31 165 ± 1 017）拷贝/μL vs.（28 471 ± 818 ）拷贝/μL;t = 23.164,P < 0.05]经离心后,外源小分子DNA片段回收效果均降低;使用10K离心浓缩管浓缩人工尿液、使用100K离心浓缩管浓缩健康人尿液均能有效提高Qiagen试剂盒回收效果（P均< 0.01）。结论　成功建立了尿液中外源日本血吸虫小分子DNA片段的提取方法,Qiagen试剂盒提取效果较好。将尿液样本pH值调整至6～8、使用100K离心浓缩管浓缩健康人尿液样本均可提高提取效果。     

基于重组酶介导核酸等温扩增技术的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法的建立

目的　结合重组酶介导核酸等温扩增技术（recombinase⁃aided isothermal amplification assay,RAA）和核酸试纸条建立一种快速检测日本血吸虫特异性基因片段的方法。方法　以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,设计并合成引物、荧光探针,建立日本血吸虫核酸试纸条检测方法。通过检测不同拷贝数的含SjG28基因片段的重组质粒和不同浓度的日本血吸虫成虫基因组DNA,对该方法敏感性进行评价;通过检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA,对该方法特异性进行评价。结果　以重组质粒为模板,建立的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法最低检测限为10拷贝/μL;以成虫基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/μL。该方法检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA结果均为阴性。结论　本研究结合RAA技术和核酸试纸条建立了一种可快速、简便、可视化检测日本血吸虫特异性基因片段的核酸试纸条法。     

快速检测田鼠巴贝西虫重组酶介导核酸等温扩增方法的建立北大核心CSCD

目的 建立快速检测田鼠巴贝西虫的重组酶介导核酸等温扩增方法(RAA)。方法 选取田鼠巴贝西虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cox I)序列,设计检测田鼠巴贝西虫的通用引物,并对引物进行筛选和特异性检测,建立并优化田鼠巴贝西虫的重组酶介导核酸等温扩增体系。分别采用重组质粒和田鼠巴贝西虫成虫DNA为模板测试方法的灵敏度;利用其他种类寄生虫DNA,包括输血传播寄生虫评估该方法的特异性并对42例外籍献血者进行田鼠巴贝西虫筛查。结果 筛选出1组扩增效果良好的引物。RAA反应过程在37℃20 min完成,最低可扩增浓度为10^(-1)copies/μL的重组质粒和浓度为10^(-3)ng/μL的田鼠巴贝西虫基因组。RAA方法具有良好的特异性,与其他寄生虫无交叉阳性反应。应用RAA方法检测42例外籍献血者标本均为阴性。结论 成功建立了一种敏感、特异的检测田鼠巴贝西虫的RAA法,该方法可用于献血者血液筛查时的快速检测以及田野调查时大规模样品检测。