硅胶法生产单克隆抗体

使杂交瘤细胞以腹水的形式生长在BALB/C小鼠体内,可产生大量单克隆抗体(1～10mg/ml,滴度超过10~(-5)。为了避免由于产生对移植细胞的免疫应答反应,导致细胞在腹腔内不能增殖的情况,通常在注射杂交瘤细胞前1周,给BALB/C小     

扩增阻滞突变系统用于ABO血型基因分型研究

目的建立一种快速、低成本的ABO血型基因分型方法。方法设计6对引物,建立扩增阻滞突变系统(ARMS),对30例中国汉族无关个体外周血样本的ABO基因型进行鉴定,并与血清学方法和直接测序结果进行比较。结果 ARMS技术检测30例样本结果同血清学方法、直接测序结果吻合率达到100%。结论该研究建立的ABO血型基因型鉴定方法可快速检测出28种ABO基因型,具有一定的临床应用价值。     

17α-己酸羟孕酮对人外周血单个核细胞抵抗地塞米松的逆转作用研究

目的探讨17α-己酸羟孕酮对外周血单个核细胞抵抗地塞米松的逆转作用。方法分离健康男性外周血单个核细胞,利用白介素2(IL-2)和IL-4以及植物血凝素刺激外周血单个核细胞,建立地塞米松抵抗的炎症细胞实验模型;单用地塞米松和地塞米松与17α-己酸羟孕酮联合应用于该模型,酶联免疫吸附法检测细胞的IL-2值的改变。结果地塞米松对植物血凝素诱导人外周血产生的IL-2呈现显著的浓度依赖性的抑制作用;用IL-2(13ng·mL-1)和IL-4(6.5ng·mL-1)刺激,再用植物血凝素(15μg·mL-1)刺激外周血单个核细胞可以作为评价地塞米松抵抗的细胞实验模型;在17α-己酸羟孕酮的浓度为10-11,10-10,10-7和10-5 mol·L-1时,可显著提高地塞米松对人外周血产生的IL-2的抑制率,降低地塞米松的IC50(半数抑制浓度)值至少100倍以上。结论 17α-己酸羟孕酮逆转外周血单个核细胞对地塞米松的抵抗,可作为地塞米松等糖皮质激素的增敏剂。     

体外研究人细胞色素P450 3A4等位基因多态性对药物代谢和药物相互作用的影响

 目的 体外研究药物对人细胞色素 P450 3A4（CYP3A4）（野生型，WT）及其 4 个突变等位基因重组酶 CYP3A4*3（M445T）、CYP3A4*4（I118V）、CYP3A4*17（F189S）和CYP3A4*18（L293P）的抑制程度。 方法 采用荧光高通量法和 HPLC 法分别测定 WT 及其 4 个突变等位基因重组酶催化荧光底物——二甲基荧光素（DBF）脱烷基化和探针底物——硝苯地平氧化反应时的酶动力学参数；且通过测定大扶康、万络、西乐葆、酮康唑、地尔硫卓和维拉帕米的半数抑制浓度（IC50）值，确定6 种药物对酶的抑制程度。 结果 除 F189S 外，其余 4 种重组酶均能催化DBF 和硝苯地平反应生成相应的产物。各突变等位基因重组酶催化 DBF 反应的 Km 值（亲和力）与 WT 相当，M445T 和 L293P 的内在清除率分别是 WT 的 3.1 和 3.8 倍（P < 0.05），I118V 是 WT 的 1.3 倍（P = 0.1010）。各重组酶催化硝苯地平氧化反应的 Km 值均比 WT 小，I118V 和 L293P 的内在清除率分别是 WT 的 0.7 和 2.6 倍（P < 0.05），M445T 与 WT 相当（P = 0.7676）。6 种药物对各重组酶的抑制程度强弱均为：酮康唑 > 地尔硫卓 > 维拉帕米 > 大扶康 > 西乐葆 > 万络；药物对各重组酶的 IC50 值大小为：WT < L293P < M445T < I118V。 结论 等位基因突变导致了酶动力学特征的改变和药物对酶抑制程度的不同，为进一步研究临床联合用药安全性奠定基础。     

分泌抗人甲胎蛋白并对肝癌细胞有特异性亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和鉴定

采用杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤SP_2/O细胞与用人甲胎蛋白抗原免疫的BALB/c小鼠脾细胞融合,经多次筛选,获得7株分泌抗人甲胎蛋白并对肝癌细胞有特异性亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其培养液上清和腹水效价分别为10~(-2)和10~(-6～9-)。杂交瘤腹水经硫酸铵盐析,DEAE纤维素层析,或免疫吸附亲和层析法纯化,每ml腹水单克隆抗体的产量为1～2mg。用ELISA,免疫双扩散、聚丙烯酰胺凝胶电泳、间接免疫荧光法鉴定了单克隆抗体的特异性、亲和力、稳定性及IgG亚类。     

瘤内注射活卡介苗抗瘤机理探讨——Ⅱ 瘤内注射卡介苗后小鼠对同种和不同种肿瘤的抵抗力

<正> 如前文所述,阻断巨噬细胞机能非但不减弱瘤内注射卡介苗的抗瘤作用,在一定程度上还增强瘤内注射卡介苗在雌性小鼠的抗瘤作用。那末,卡介苗瘤内注射究竟怎样发挥抗瘤作用呢? 关于这个问题,我们曾将各种看法归纳为五个方面,并提出卡介苗瘤内注射具有以卡介苗作为佐剂的自身瘤苗的作用。为了能对阐明这个问题提供一些线索,我们作了以下实验。     

小鼠腹腔巨噬细胞硅中毒后血清溶菌酶、胸腺和脾脏重量等参数的动力学变化

<正> 巨噬细胞硅中毒可以导致一部分小鼠死亡,可见,巨噬细胞是一种生命必需细胞。巨噬细胞硅中毒后,雌性小鼠移植性肿瘤生长明显加快,而雄性小鼠移植性肿瘤生长速度却变化不大。为了深入研究这些现象,我们观象了巨噬细胞硅中霉后几个指标的动力学变化。     

体外重组人细胞色素P450 2C9 酿酒酵母表达体系的构建及其基因多态性对药物相互作用影响的初探

 目的 体外构建重组人细胞色素 P450 2C9（CYP2C9）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达体系,且利用该体系研究药物对 CYP2C9 基因多态性酶抑制程度的差异性。 方法 将 CYP2C9*1（野生型）和通过定点突变 PCR 法获得的等位基因突变克隆 CYP2C9*2（R144C 突变体）和 CYP2C9*3（I359L 突变体）电穿孔转化酿酒酵母后,差速离心法制备酿酒酵母微粒体,蛋白免疫印迹法检测 3 种 CYP2C9 微粒体蛋白的表达;HPLC 法检测 CYP2C9*1 与特异性底物双氯芬酸的反应,记录产物峰面积值,利用 PrismDemo 软件计算米氏常数（Km）值;利用荧光底物 BOMCC 对 3 个等位基因进行酶活性分析,分别计算 Km、最大酶促反应速度（Vmax）和内在清除率。采用荧光高通量方法测定 5 种药物（甲苯磺丁脲、磺胺苯比唑、酮康唑、氟西汀和泰洛平）对酶的抑制程度。 结果 蛋白免疫印迹结果表明,3 个等位基因均表达目的蛋白。CYP2C9*1 代谢双氯芬酸的 Km 值为 5.34 ± 0.96 μmol/L;以 BOMCC 为底物时,CYP2C9*1 和 CYP2C9*2 的 Km 值分别为 16.94 ± 4.78、34.73 ± 5.51 μmol/L,Vmax 分别为 0.21 ± 0.10、0.12 ± 0.01 pmol/（min&;#8226;pmol P450）,内在清除率分别为 0.012 ± 0.003、0.003 ± 0.0001 µl/（min&;#8226;pmol P450）;CYP2C9*3 无催化活性。5 种药物对 CYP2C9*1 的抑制程度：磺胺苯比唑 > 酮康唑 > 氟西汀 > 甲苯磺丁脲 > 泰洛平;对 CYP2C9*2 的抑制程度：磺胺苯比唑 > 甲苯磺丁脲 > 酮康唑 > 氟西汀 > 泰洛平。 结论 成功构建了重组人细胞色素 CYP2C9 及其多态性等位基因（CYP2C9*2、CYP2C9*3）酿酒酵母表达系统;初步建立了药物对 CYP2C9 基因多态性酶的抑制作用体外检测体系,为指导临床联合用药奠定了基础。     

HCV非结构蛋白质5A基因全长和高免疫源区的表达及免疫活性检测

目的探讨HCV非结构蛋白质5A（NS5A）基因全长和高免疫源区的表达并比较其检测灵敏度。方法以含HCV全基因组的质粒pBR^tm／HCV-3011（1b型）为模板，采用PCR方法扩增出NS5A全长基因（以下用NS5AL代替）和高免疫源区基因（以下用NS5AS代替），与pET-32a载体相连接构建重组表达载体pET-NS5AL和pET-NS5AS，分别转化E.coli Rosetta（DE3）pLysS和BL21（DE3）感受态细胞，经异丙幕-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后，蛋白质印迹法检测其表达，镍螯合（Ni2^＋-NTA）琼脂糖亲和层析柱纯化重组NS5AL和NS5AS蛋白，最后通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性并对其榆测灵敏度进行比较。结果SDS—PAGE鉴定与蛋白质印迹验证结果表明，重组NS5AL和NS5AS蛋白均得到很好地表达；纯化的重组NS5AL和NS5AS蛋白浓度分别为0．146和0．426mg／ml，纯度均〉96％；ELISA检测结果表明，重组NS5AL和NS5AS蛋白均具有较好的免疫活性，且重组NS5AL蛋白的检测灵敏度明显高于NS5AS。结论成功地表达出重组NS5AL和NS5AS蛋白，均具有较高的免疫活性，将有助于提高HCV临床检测的灵敏度。     

小鼠胸腺大小随龄变化的性别差异及其原因探讨

<正> 众所周知,老年人的胸腺在形态上表现为明显萎缩;在机能上表现为细胞免疫功能衰退,血中胸腺素含量显著降低。老年病学者和免疫学家都一致认为,胸腺功能(因而细胞免疫功能)低下是早衰和老年发病的重要原因之一。统计表明,女性的寿命一般比男性长,通常相差4～8岁。在其他多细胞动物中也总是雌性的寿命较长。既然两性的寿命有明显的差异,胸腺又与早衰和老年病的发生有密切的关系,那末两性胸腺是否有某种差异存在呢? 任何器官机能的变化都以形态的变化为基础,胸腺亦不例外。胸腺大小的变化是一个十