Alport综合征及其分子生物学研究

Ａｌｐｏｒｔ综合征（遗传性肾炎）是一种Ｘ染色体连锁的遗传疾病。利用限制性片段长度多态性技术，缺隐性基因定位在ＸＱ２２－２６区域。这种疾病具有进行性血尿症状并最终导致终末期肾疾病，同时还可能伴有一些非肾病症状，诸如听力丧失，圆锥形晶状体，视网膜异常，血小板症等。主要的病理学发现是肾小球基底膜超微结构的变化，包括区域性变薄，增厚和致密层分离，这表明缺陷在于ＧＢＭ结构框架，它是由ＧＢＭ特有的胶原Ⅳ型分了     

重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子下游处理研究(Ⅰ)

目的 在成功构建人粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)高效表达克隆的基础上,对表达产物进行实验室规模和中试规模的分离、纯化及对rhGM—CSF在溶液中的稳定性进行研究。方法 应用工程菌发酵、超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层折、复性、离子交换等方法对rhGM—CSF进行纯化,并用GM—CSF依赖株TF-1细胞MTT法测定其生物学活性及应 用透析法测定其在溶液中的稳定性。结果 终产物纯度达99％,比活性达1.5×10~7u/mg蛋白。在偏硷性溶液中会发生降解,但降解后生物活性未见明显下降。结论 采用分子筛色谱和阴离子交换色谱对GM—CSF进行纯化,经从实验室规模放大至中试规模证明该工艺是简便可行的,得到了高纯度、高比活性的纯品。     

人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的半合成及其克隆表达

目的 将人胰岛素样样生长因子Ⅰ（ＩＧＦ－Ⅰ）基因克隆到ｐＥＴ１１Ｃ中，构建成ｐＥＴＩＧＦ－Ⅰ表达载体，完成人ＩＧＦ－Ⅰ基因大在大肠杆菌中的表达。方法 利用固相亚磷酸三酯法化学合成人ＩＧＦ－Ⅰ基因的２条寡核苷酸片段，通过互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平成完整的ＩＧＦ－Ⅰ双链ＤＮＡ片段，然后经酶切克隆于ｐＴＶ１１８Ｎ载体中，构建ｐＴＶＩＧＦ－Ⅰ克隆载体并测定ＤＮＡ序列后，构建ｐＥＴＩＧＦ－Ⅰ表达载体。结     

分子伴侣HSP70研究进展

分子伴侣HSP70在原核、真核细胞均已发现,它们具有共同的生化特征,在细胞内各自分布在特定的区域。其主要生物学功能是促进新生多肽链的正确折叠,对于分子重排、解离聚集蛋白和新生多肽的膜运输也具有重要的辅助作用。     

重组人粒／巨噬细胞集落刺激因子下游处理研究（I）

在成功构建了人粒／巨噬细胞集落刺激因子高效表达克隆的基础上，对表达产物进行实验室规模和中试规模的分离，纯化及对ｒｈＧＭ－ＣＳＦ在溶液中的稳定性进行研究。方法 应用工程菌发酵超声破菌，包涵体抽提，凝胶过滤层析，复性，离子交换等方法对ｒｈＧＭ－ＣＳＦ进行纯化，并用ＧＭ－ＣＳＦ依赖株ＴＦ－１细胞ＭＴＴ法测定其生物学活性及应用透析法测定其在溶液中的稳定性。     

利用傅里叶变换红外光谱法研究重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子溶液中的构象

利用傅里叶变换红外光主普（FTIR）技术研究了重组人粒细胞——巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF)在重水（D2O）溶液中的二级结构，结果表明：20℃时rhGM-CSF含有35%α-螺施，32%β-折叠，11%转角和20%无规卷曲。     

Alport综合征及其分子生物学研究

Ａｌｐｏｒｔ综合征（遗传性肾炎）是一种Ｘ染色体连锁的遗传疾病［１，２］。利用限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）技术，缺陷性基因定位在Ｘｑ２２－２６区域［３，４，５］。这种疾病具有进行性血尿症状并最终导致终末期肾疾病，同时还可能伴有一些非肾病症状，诸如听力丧失、圆锥形晶状体、视网膜异常、血小板减少症等。主要的病理学发现是肾小球基底膜（ＧＢＭ）超微结构的变化，包括区域性变薄，增厚和致密层分离，这表明缺陷在于ＧＢＭ结构框架，它是由ＧＢＭ特有的胶原Ⅳ型（ＣＯＬ４）分子形成的复杂网状物。近年来，许多学者致力于Ａｌｐｏｒｔ综合征的分子生物学研究，尤其是胶原Ⅳ型α５亚基（ＣＯＬ４Ａ５）基因，已对其进行了ｃＤＮＡ克隆和基因结构及序列分析［６］，发现了５种大片段缺失和７种点突变。     

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子溶液中的稳定性初探

在大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）纯化的基础上,我们研究了其在溶液中的稳定性,发现它在pH6.8的PBS缓冲液中稳定性很好,但在pH8.3的Tris·HCl冲浪中时隔2 wk以上即发生降解,SDS-BAGE分析,相应位置变成两条带,将SDS-PAGE胶电转移至PVDF膜,将膜上出现的两条蛋白染色带剪下,进行N端氨基酸序列分伍,两蛋白均有固定的降解位点.降解的蛋白与未降解的相比,生物活性仅有较激下降。     

聚乙二醇增加重组人粒—单系集落刺激因子复性效率的研究

重组人粒－单系集落刺激因子在大肠杆蓖表达后积累在细胞中形成包涵体，在变性的包涵体的现提液复性过程中，目的产物可能聚积而使活性蛋白的得率降低。本研究对聚乙二醇增加复性的能力进行试验。将ｒｈＧＭ－ＣＳＦ在６ｍｏｌ／Ｌ尿素中变性，迅速稀释到不同浓度尿素和ＰＥＧ的溶液中并保护蛋白浓度为０．２ｍｇ／ｍｌ，在尿素浓度为２．０ｍｏｌ／Ｌ，ＰＥＧ４０００对ｒｈＧＭ－ＣＳＦ的摩尔比为２０：１时活性蛋白从４０％增加到     

牛肝二硫键异构酶的纯化及其对重组人粒/单系集落刺激因子体外折叠作用的研究

自牛肝中纯化二硫键异构酶（PDI）。经匀浆、热沉淀、硫酸铵分级分离、阳离子和阴离子交换层析等步骤，得到了比活950U／g电泳纯的PDI。在此基础上研究了PDI对重组人粒／单系集落刺激因子（rhGM－CSF）体外复性作用。结果表明，在PDI与rhGM－CSF摩尔比为2：1时，可使0．5mg／ml的rhGM－CSF正确折叠率提高到60％，比活性由5．0×106U／mg提高到1．0×107U／mg。