鳖甲煎丸对肝纤维化模型大鼠肝组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及其靶基因表达的影响

目的探讨鳖甲煎丸治疗肝纤维化的可能作用机制。方法 48只大鼠随机分为空白对照组、模型组、秋水仙碱组和鳖甲煎丸低、中、高剂量组,每组8只。除空白对照组外其余各组大鼠腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立肝纤维化模型。首次注射后第2天开始给药,鳖甲煎丸低、中、高剂量分别给予为鳖甲煎丸混悬液0.55、1.1、2.2 g/(kg·d)灌胃,秋水仙碱组给予秋水仙碱片混悬液0.11 mg/(kg·d)灌胃,空白对照组和模型组给予2 ml生理盐水灌胃,共8周。Masson染色观察肝脏病理形态学改变;检测各组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)等肝功能指标,及超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(HYP)、转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)水平;Westernblot法检测大鼠肝组织中β-链蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK-3β)、蛋白激酶B(AKT)和磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的表达。结果与模型组比较,鳖甲煎丸各剂量组均不同程度纤维组织增生明显减少,血清ALT、AST含量及MDA、HYP、TGF-β1、CTGF、TNF-α、VEGF水平降低,SOD水平升高(P<0.05),肝组织中β-catenin、p-GSK-3β和p-AKT蛋白表达明显减少,且以鳖甲煎丸高剂量组效果更佳(P<0.05)。各组大鼠肝组织中GSK-3β和AKT蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论鳖甲煎丸能够显著减轻CCl4致大鼠肝纤维化的程度,可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化、减少其下游靶基因的表达水平有关。     

以GSK-3β为靶标的miRNAs调控肝细胞癌侵袭转移的研究进展

侵袭转移是导致肝细胞癌高死亡率的关键原因之一,其机制复杂。在肝细胞癌的侵袭转移过程中,miRNAs可作为致癌基因或抑癌基因调节肿瘤细胞的分化、增殖,对肿瘤形成、血管生成及侵袭和转移具有重要影响。本文重点综述了以GSK-3β为靶标的miRNAs调控肝细胞癌侵袭转移的分子机制研究进展,具体涉及到miRNAs与肝细胞癌的细胞增殖、凋亡、侵袭、转移及对GSK-3β的调控作用等相关性研究内容。     

鳖甲煎丸对大鼠肝星状细胞增殖与凋亡的影响北大核心CSCD

目的通过研究鳖甲煎丸药物血清对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用及诱导其凋亡的影响,探讨鳖甲煎丸抗肝纤维化的可能作用机制。方法 Wistar大鼠40只,系统随机抽样(抓阄法)分为阴性对照组(NC组)、阳性药对照组(P组)、鳖甲煎丸高(H)、中(M)、低(L)剂量组,每组8只。L、M、H剂量组分别按21.87、43.75、87.50mg/mL灌服鳖甲煎丸混悬液。P组灌胃0.01mg/mL秋水仙碱溶液,NC组灌予等量的生理盐水。每只大鼠每次灌胃2mL,每日2次。每次灌胃间隔12h,连续灌胃7次,制备药物血清。将HSC-T6分为药物血清组(H/M/L/NC组)、秋水仙碱对照组(P组)及空白对照组(BC组),H、M、L、NC及P组给予对应药物血清进行培养,BC组为不含药物血清的培养基。采用CCK8法检测HSC-T6细胞24、48、72h时增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期,Western blot法检测凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平。结果与NC组比较,M、H、P组24h细胞增殖抑制率明显增高(P<0.05);48、72h时与NC组比较,L、M、H、P组细胞增殖抑制率明显增高(P<0.05)。但24、48、72h各时间点之间L、M、H、P组细胞增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组、BC组比较,M、H、P组的HSC-T6早期凋亡与晚期凋亡率明显升高(P<0.05),M、H、P组G0/G1期细胞数明显增多(P<0.05),L、M、H、P组S期与G2/M期细胞数明显减少(P<0.05)。各组间Bcl-2蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组比较,P、H、M、L组的Bax蛋白表达明显升高(P<0.01)。结论鳖甲煎丸抗肝纤维化的作用机制可能与其抑制肝星状细胞增殖并诱导其凋亡有关。     

鳖甲煎丸通过TGF-β/Smad信号通路抑制DEN诱导肝癌大鼠上皮间质转化的机制

目的:通过研究鳖甲煎丸对二乙基亚硝胺(DEN)诱导肝癌模型大鼠中转化生长因子-β(TGF-β)/Smad通路信号分子及下游靶基因的影响,探讨鳖甲煎丸抗肝癌侵袭转移的分子机制。方法:大鼠分为正常组、模型组、鳖甲煎丸组(2.2 g·kg-1·d-1),对模型组及鳖甲煎丸组大鼠使用DEN进行腹腔注射,诱导大鼠肝脏发生肝炎-肝硬化-癌变病理改变,鳖甲煎丸组在肝硬化阶段给予鳖甲煎丸连续灌胃6周,收集血清及肝脏标本。采用试剂盒检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),总胆红素(TBIL),白蛋白(Alb),γ-谷氨酰转肽酶(GGT),碱性磷酸酶(ALP);苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肝脏病变;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测转化生长因子(TGF)-β1的mRNA转录水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TGF-β/Smad通路中TGF-β1,Smad2/3,磷酸化Smad2/3及上皮间质转化标志物N-钙黏蛋白(N-cadherin),E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的蛋白表达水平。结果:鳖甲煎丸组与模型组之间肝功能指标差异均无统计学意义。与模型组比较,鳖甲煎丸能改善大鼠肝癌组织中细胞呈气球样变性、水肿、凝固性坏死的病理变化,降低肝癌组织中TGF-β1mRNA转录及蛋白表达水平(P0.01),下调磷酸化Smad2蛋白表达水平(P0.01),同时下调下游靶基因蛋白N-cadherin,Vimentin蛋白表达水平(P0.01)。结论:鳖甲煎丸可能通过减少肝癌组织中TGF-β1的表达水平,抑制由TGF-β/Smad通路激活介导的肝癌细胞上皮间质转化(EMT),从而达到抗肝细胞癌转移侵袭的作用。     

鳖甲煎丸通过Wnt/β-catenin信号通路逆转大鼠肝卵圆细胞EMT的机制

目的 研究鳖甲煎丸对转化生长因子-β₁（TGF-β₁）诱导的大鼠肝卵圆细胞WB-F344上皮间质转化（EMT）的影响,探讨其逆转EMT改变的作用机制。方法 将WB-F344细胞随机分为空白组,TGF-β₁模型组（10 μg·L^-1TGF-β₁）,鳖甲煎丸低剂量组（10 μg·L^-1TGF-β₁+0.55 g·kg^-1鳖甲煎丸）,鳖甲煎丸中剂量组（10 μg·L^-1TGF-β₁+1.1 g·kg^-1鳖甲煎丸）,鳖甲煎丸高剂量组（10 μg·L^-1TGF-β₁+2.2 g·kg^-1鳖甲煎丸）,除空白组外,均采用TGF-β₁诱导WB-F344细胞构建EMT模型,分别加入鳖甲煎丸低、中、高剂量含药血清处理细胞,采用细胞划痕实验检测WB-F344细胞迁移能力的改变;使用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）,N-钙黏蛋白（N-cadherin）,波形蛋白（Vimentin）表达的变化;使用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测β-连环蛋白（β-catenin）mRNA表达的改变;使用细胞免疫荧光法检测β-catenin的表达。结果 与空白组比较,TGF-β₁诱导WB-F344细胞4 d,WB-F344细胞间隙从紧密逐渐变得松散,细胞形态由鹅卵石状向成纤维样细胞转变,且E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin蛋白表达升高（P<0.01）,说明成功构建了WB-F344细胞EMT模型。划痕实验结果显示,与空白组比较,TGF-β₁模型组WB-F344细胞的迁移能力增强（P<0.01）;与TGF-β₁模型组比较,鳖甲煎丸中、高剂量组可以明显抑制WB-F344细胞的迁移能力（P<0.05）。Western blot结果显示,与空白组比较,TGF-β₁模型组E-cadherin蛋白表达水平降低,N-cadherin,Vimentin蛋白表达水平升高（P<0.01）;与TGF-β₁模型组比较,鳖甲煎丸中、高剂量组E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin,Vimentin蛋白表达降低（P<0.05,P<0.01）。Real-time PCR结果显示,与空白组比较,TGF-β₁模型组中β-catenin mRNA表达升高（P<0.01）;与TGF-β₁模型组比较,鳖甲煎丸低、中、高剂量组中β-catenin mRNA的表达降低（P<0.01）。细胞免疫荧光结果显示,与空白组比较,TGF-β₁模型组β-catenin在细胞核内荧光表达增强;与TGF-β₁模型组比较,鳖甲煎丸低、中、高剂量组β-catenin在细胞核内荧光表达减弱,且鳖甲煎丸对细胞核内β-catenin抑制作用与其浓度呈正相关。结论 鳖甲煎丸可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,逆转TGF-β₁诱导WB-F344细胞的EMT进程,抑制WB-F344细胞的迁移能力。     

鳖甲煎丸对HepG2裸鼠移植瘤Wnt信号通路相关分子及靶基因的影响

目的:通过研究鳖甲煎丸对人肝癌Hep G2裸鼠移植瘤组织中Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路相关信号分子及靶基因表达的影响,探讨鳖甲煎丸抗肝细胞癌的分子机制。方法:建立裸鼠移植瘤肝癌模型,随机分为鳖甲煎丸高、中、低剂量(2.2,1.1,0.55 g·kg-1)组,模型组,正常组,肉眼观察鳖甲煎丸对人肝癌Hep G2裸鼠移植瘤生长的抑制作用,免疫组化检测移植瘤组织中β-catenin和T-框蛋白3(TBX3)的表达水平,免疫印迹法(Western blot)检测其移植瘤组织中p19ARF,双微基因2(MDM2),p53的表达水平。结果:鳖甲煎丸对人肝癌Hep G2裸鼠移植瘤生长具有明显的抑制作用,鳖甲煎丸能够抑制其移植瘤组织中β-catenin和TBX3的表达,和模型组比较,鳖甲煎丸高、中剂量组中β-catenin和TBX3表达均明显降低(P0.05)。同时,鳖甲煎丸能够促进人肝癌Hep G2裸鼠移植瘤组织p19ARF和p53表达,并抑制MDM2表达,鳖甲煎丸高、中剂量组p19ARF,p53,MDM2表达较模型组均有明显差异(P0.05)。结论:鳖甲煎丸能通过影响Wnt/β-catenin通路,调控β-catenin和TBX3的表达,继而通过调控TBX3/p19ARF/MDM2通路激活抑癌基因p53,最终抑制肝癌细胞的增殖并诱导其出现凋亡,从而达到抗肝细胞癌的目的。     

基于PI3K/AKT/GSK-3β信号通路探讨鳖甲煎丸调控肝癌细胞Hep3B增殖转移的机制

目的:研究鳖甲煎丸对肝癌细胞Hep3B增殖和转移的影响,探讨其抗肝细胞癌的作用机制。方法:分别使用不同浓度的鳖甲煎丸药物血清培养肝癌细胞Hep3B,采用CCK8、细胞划痕实验观察肝癌细胞增殖和转移能力的改变;采用Western Blot检测PI3K、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白表达的变化。结果:与NC组比较,各给药组均能显著抑制肝癌细胞Hep3B的增殖和转移(P<0.05),p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达均显著下调,GSK-3β蛋白表达水平均显著上调(P<0.05);E-cadherin蛋白表达水平均显著上调,而N-cadherin、Snail蛋白表达水平均显著下调(P<0.05);其中,H组可显著下调PI3K蛋白表达水平(P<0.05),其他各组变化不明显。结论:鳖甲煎丸可以显著抑制肝癌细胞Hep3B的增殖和转移,其机制可能与通过PI3K/AKT/GSK-3β信号通路调控Snail转录因子来调节上皮间质转化有关。     

鳖甲煎丸对CCl4致大鼠肝纤维化模型中NF-κB信号通路的影响

目的:通过研究鳖甲煎丸对四氯化碳(CCl_4)致大鼠肝纤维化的抑制作用及其对核转录因子-κB(NF-κB)信号通路信号分子及靶基因的影响,探讨鳖甲煎丸抗肝纤维化的作用机制。方法:使用CCl4复制肝纤维化大鼠模型,鳖甲煎丸药物溶液灌胃,8周末腹主动脉采血,留肝组织检测指标。苏木素-伊红(HE)染色观察肝脏病理形态学改变;酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组大鼠血清中肝纤维化4项,基质金属蛋白酶(MMP)-2,MMP-9,组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的表达;免疫组化法检测大鼠肝组织中p65,转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠肝组织中p65,NF-κB抑制蛋白(IκB)α,IκB激酶(IKK)α/β,TGF-β1的表达。结果:病理学结果显示模型组肝小叶被破坏,纤维组织增生严重,而鳖甲煎丸治疗组肝细胞坏死减少,纤维组织增生明显减少,纤维间隔薄;与模型组比较,鳖甲煎丸治疗组大鼠肝纤维化4项指标,TIMP-1含量明显降低(P0.05),而MMP-2,MMP-9含量明显上升(P0.05);免疫组化结果显示鳖甲煎丸治疗组肝组织p65,TGF-β1表达较模型组明显降低,Western blot检测结果显示与模型组比较,鳖甲煎丸治疗组肝组织中p65,TGF-β1蛋白表达明显减少(P0.05),IκBα蛋白表达明显增加(P0.05),而IKKα/β则无显著变化。结论:鳖甲煎丸能够显著减轻四氯化碳致大鼠肝纤维化的程度,减缓其发展,主要与鳖甲煎丸能够抑制p65的表达,从而阻断NF-κB信号通路,减少其下游靶基因TIMP-1,TGF-β1的合成,上调MMP-2,MMP-9的表达,从而加快细胞外基质的降解有关。