大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的 从大蒜鳞茎中克隆蒜氨酸酶基因,构建蒜氨酸酶真核表达载体,并在毕赤酵母系统中表达,进一步探讨重组蒜氨酸酶的生物学活性。方法 利用RT-PCR方法克隆大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因,通过pPIczαC载体构建pPIczαC-蒜氨酸酶真核表达质粒,电转化法导入毕赤酵母X-33,筛选阳性克隆,经甲醇诱导后取表达上清进行SDS-PAGE和Western blotting分析。利用丙酮酸法检测重组蒜氨酸酶和提取的天然蒜氨酸酶的活性,Lowry法测2种蒜氨酸酶蛋白质量,通过比活力比较2种酶活性大小。结果 从大蒜内克隆出蒜氨酸酶基因,大小为1 500 bp,重组蒜氨酸酶相对分子质量约为5.5×10⁴,存在于毕赤酵母表达上清液中。重组蒜氨酸酶比活力为（82.09±3.89）U/mg,天然蒜氨酸酶比活力为（176.49±5.06）U/mg。结论 蒜氨酸酶基因可以在毕赤酵母表达系统中获得表达,重组蒜氨酸酶具有酶活性,但是其活性低于提取的天然蒜氨酸酶。     

大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的从大蒜鳞茎中克隆蒜氨酸酶基因,构建蒜氨酸酶真核表达载体,并在毕赤酵母系统中表达,进一步探讨重组蒜氨酸酶的生物学活性。方法利用RT-PCR方法克隆大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因,通过pPIczαC载体构建pPIczαC-蒜氨酸酶真核表达质粒,电转化法导入毕赤酵母X-33,筛选阳性克隆,经甲醇诱导后取表达上清进行SDS-PAGE和Western blotting分析。利用丙酮酸法检测重组蒜氨酸酶和提取的天然蒜氨酸酶的活性,Lowry法测2种蒜氨酸酶蛋白质量,通过比活力比较2种酶活性大小。结果从大蒜内克隆出蒜氨酸酶基因,大小为1 500 bp,重组蒜氨酸酶相对分子质量约为5.5×104,存在于毕赤酵母表达上清液中。重组蒜氨酸酶比活力为(82.09±3.89)U/mg,天然蒜氨酸酶比活力为(176.49±5.06)U/mg。结论蒜氨酸酶基因可以在毕赤酵母表达系统中获得表达,重组蒜氨酸酶具有酶活性,但是其活性低于提取的天然蒜氨酸酶。     

丹参素对H2O2诱导的内皮细胞氧化损伤的保护作用研究

目的:探讨丹参素对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)氧化损伤的保护作用。方法:采用MTT法测定丹参素对正常和H2O2损伤HUVEC活性的影响,筛选出最低有效剂量,并确定丹参素保护HU-VEC氧化损伤的浓度。通过活体探针标记、流式细胞术定量分析丹参素对损伤HUVEC细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位的影响。结果:丹参素对正常HUVEC的活性无影响;而丹参素(25、50、250μmol/L)能显著降低H2O2诱导的HUVEC活性,具有一定的剂量依赖性,细胞活性分别为H2O2损伤组的120.72%、177.48%和736.48%(P<0.01)。丹参素可明显降低H2O2诱导的HUVEC内ROS水平(P<0.01)和提高线粒体膜电位(P<0.05,P<0.01)。结论:丹参素对H2O2诱导HUVEC损伤的保护作用可能是通过抑制细胞内ROS产生、减少线粒体膜损伤而发挥抗氧化作用。