金银花不同发育时期挥发性成分的HS-SPME-GC-MS分析

目的 探讨金银花Lonicerae Japonicae Flos不同发育时期挥发性成分的差异。方法 采用顶空固相微萃取-气质联用技术（HS-SPME-GC-MS）,结合保留指数方法,对米蕾期（RB）、三青期（TG）、二白期（TW）、大白期（BW）、银花期（HS）、金花期（GF）6个不同时期金银花的挥发性成分进行定性定量分析,并通过主成分分析和聚类分析对6个不同生长时期的金银花挥发性物质进行判定、区分和聚集。结果 GC-MS共鉴定出260种挥发性物质,对260个物质进行主成分分析可简化为5个主成分,累积方差贡献率达86.65%,可反映样品的大部分信息;通过主成分分析和聚类分析将6个不同生长时期金银花样品分为4类：其中RB和TG归为1个集群;TW单独归为1个集群,BW和HS归为1个集群;GF单独归为1个集群。结论 聚集在一起的金银花样品挥发性物质相似,将RB与TG,TW,BW与HS,GF分为4个不同的商品等级,该研究结果可为金银花混合采摘以及后期的生产加工提供理论依据。     

忍冬VIGS基因沉默体系构建

目的 以忍冬Lonicera japonica八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase,PDS）基因为标记基因,利用ZMBJ-CMV载体建立基于病毒诱导的忍冬基因沉默体系。方法 以忍冬为材料,通过选取同源性较高的片段设计PDS基因的特异性引物,克隆出片段长度为135 bp的序列作为目的基因片段,经双酶切后与黄瓜花叶病毒载体连接构建VIGS重组载体,转化根癌农杆菌后,侵染忍冬幼苗。此外,还对农杆菌吸光度（A）值和侵染方法对PDS基因沉默效率的影响进行了比较。结果 被侵染植株叶片PDS基因表达水平显著降低,叶绿素和类胡萝卜素含量显著下降,叶片出现白化表型。结论 建立了以ZMBJ-CMV载体诱导的忍冬基因沉默体系,农杆菌A值为0.8、注射后再进行真空浸润,能够提高忍冬目标基因的沉默效率,为开展忍冬关键基因的功能研究提供了技术支撑。     

忍冬U6启动子的克隆及功能验证

以忍冬基因组DNA为模板,克隆并筛选出具有较高转录活性的忍冬U6启动子。采用PCR方法,从忍冬基因组中克隆到4个LjU6启动子,长度分别为336、708、359、602 bp, PlantCARE分析发现4个启动子中均含有TATA框以及CAAT框等典型的启动子顺式元件,且包含与光响应、胁迫响应等相关的调控元件;克隆产物经测序正确后,将LjU6启动子连接至携带β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的pBI121载体,成功构建4个LjU6-pBI121融合表达载体,通过农杆菌瞬时转化法转化烟草叶片,并对叶片进行GUS组织化学染色,染色结果显示LjU61-F1转录活性最高,本研究初步筛选出转录活性较高的忍冬U6启动子,为忍冬CRISPR/Cas9基因组编辑技术的建立奠定了基础。     

金银花新品种“华金6号”长蕾期表型形成机制解析

围绕金银花新品种“华金6号”长蕾期表型,以“华金6号”及“大毛花”为材料,探究其表型形成机制。检测内源茉莉酸类植物激素(jasmonic acid hormones, JAs)含量;对忍冬进行转录组分析,确定与茉莉酸(jasmonic acid,JA)合成相关基因;采集不同时期“华金6号”及“大毛花”的花蕾及花,利用qRT-PCR (quantitative real-time PCR)技术,分析合成相关酶基因在金银花花蕾期表达量的变化趋势。研究发现“华金6号”金银花中JAs含量显著低于“大毛花”;对“华金6号”喷施外源茉莉酸甲酯(methyl-jasmonate, MeJA)可以恢复其开花表型,使其趋近于“大毛花”;2个丙二烯氧化物合酶基因(allene oxide synthase, AOS)、3个脂氧合酶基因(lipoxygenase, LOX)及2个丙二烯环氧化酶基因(allene oxide cyclase, AOC)在“华金6号”和“大毛花”不同时期花及花蕾中的表达量具有显著差异。推测JA合成相关酶基因在“华金6号”中的低表达导致JA合成受阻,从而引起长蕾期表型的形成。本研...     

干旱胁迫下忍冬全基因组DNA甲基化和转录组分析

目的 分析干旱胁迫下忍冬Lonicera japonica全基因组DNA甲基化水平变化、模式以及与基因表达的关系,为进一步探究忍冬响应干旱胁迫的分子机制奠定基础。方法 采用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序法（whole-genome bisulfite sequencing,WGBS）,测定干旱胁迫下忍冬全基因组DNA甲基化水平,并联合转录组测序结果对差异甲基化基因相关的差异表达基因进行分析。结果 干旱胁迫下忍冬整体甲基化水平普遍上升;其中CG类型甲基化水平明显高于CHG或CHH甲基化类型;对不同干旱胁迫处理下的忍冬进行差异甲基化区域（differentially methylated regions,DMR）分析,发现1935、2158和1750个差异甲基化相关基因,基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析表明,显著富集的通路主要包括亚油酸代谢,氮代谢通路和次生代谢物的生物合成通路等。通过转录组测序技术,发现差异甲基化基因相关的差异表达基因主要富集于次生代谢产物合成相关通路,同时筛选出4个在干旱胁迫下基因表达量上升显著的忍冬MYB（Lonicera japonica MYB,LjMYB）LjMYB转录因子。结论 干旱胁迫下忍冬甲基化水平上升,推测DNA甲基化调控基因表达是干旱影响金银花有效成分生物合成的作用机制之一。