天麻素生物合成的研究进展

天麻素是我国名贵中药材天麻中的一种主要活性成分，具有降血压、抗癫痫、抑制肿瘤、保护神经等多方面的药理活性。随着市场对天麻素需求的不断增长以及传统获取方法固有的问题，导致急需新的方法来解决天麻素生产实际中面临的各项困难。生物合成法是一种有别于传统获取法的新方法，已在天麻素获取上取得了较大进展和成果，故现阶段有必要从天麻素生物合成途径、植物转化法和微生物转化法3个方面，对天麻素生物合成进行系统地阐述，从而为进一步改进和完善天麻素生产方法，以满足人们对其不断增长的需求提供有价值的参考。     

小叶女贞糖基转移酶基因的克隆和原核表达研究

根据前期小叶女贞转录组研究的结果,利用c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)从叶片中克隆到1条编码糖基转移酶的基因(xynz UGT)。该基因c DNA全长1 598 bp,由66 bp 5'-UTR,1 440 bp ORF,92 bp 3'-UTR组成,其中ORF编码1条含480个氨基酸残基的酶蛋白(xynz UGT),其相对分子质量和等电点分别为54 826.67 Da和5.82。利用生物信息学方法分析酶蛋白的结构,结果表明在一级结构中含有一段糖基转移酶高度保守的PSPG盒,在二级结构中含有α螺旋(38%)、β折叠片(12.1%)和无规蜷曲(49.9%),在三级结构中由肽链折叠形成2个正对的α/β/α类Rossmann折叠区域,并且两者之间夹着一个底物结合口袋。通过系统进化树分析发现,xynz UGT有可能催化酪醇等苯丙素类物质发生糖基化,进一步开展酶蛋白与酪醇的分子对接模拟实验,结果显示位于结合口袋的Gly138和Ser285通过氢键与酪醇发生相互作用。SDS-PAGE电泳分析表明,原核表达系统成功表达出相对分子质量为58 370.57 Da的xynz UGT重组蛋白,但它以非可溶性的包涵体形式存在。利用分子伴侣和酶蛋白共表达的方法,在一定程度上可促进酶蛋白的可溶性表达。以上研究结果为进一步开展体外酶促反应研究,并阐明酶的功能机制奠定了基础。     

益母草悬浮细胞系的建立及转化外源氢醌生成熊果苷研究

目的建立益母草悬浮细胞系,并对其转化生成熊果苷的条件进行优化。方法以前期实验优选出的愈伤组织为材料建立悬浮细胞系,加入氢醌并培养一段时间后,测定胞内与胞外熊果苷产量,计算转化率。结果建立的益母草悬浮细胞系分散性良好,通过生长曲线的测定,确定加入氢醌的最佳时期为接种培养的第6日;通过对不同浓度氢醌、不同转化时间的研究,结合熊果苷产生的动力学研究,优选出加入3mmol/L氢醌转化12h的熊果苷总产量及胞内产量最高,氢醌转化率也较高。结论益母草悬浮细胞生长速度快,转化氢醌生成熊果苷的能力较强,有望开发成为新的生物转化体系。     

基于高通量测序的女贞果实转录组研究

目的:利用Illumina/Solexa Hiseq2000测序平台对女贞果实进行转录组测序。方法:将测序得到的大量数据进行拼接与组装,并应用生物信息学方法对所得序列进行功能注释、功能分类、代谢途径分析和简单重复序列位点查找等研究。结果:共获得32 856 614条clean reads,含4.93 Gb的有效数据。对clean reads应用Trinity软件进行组装,共获得163 092条unigene,总长度、平均长度和N50分别为108.57 Mb、665.68 bp和1345 bp。公共数据库(Nr,Nt和Swiss Prot数据库)的BLAST比对分析显示,有83 903条unigene获得基因注释,进一步的功能分类表明,在GO数据库中有16 876条unigene可被分别注释到细胞组分、分子功能和生物学过程三大类别中。将unigene与COG数据库进行比对,可获得25个功能类别,其中较多unigene涉及果实中物质的合成与转运相关的营养功能。KEGG数据库作为搜索对象,可将unigene定位到21类代谢途径中,涉及重要次生代谢产物黄酮类和萜类生成的unigene数目分别为258条和929条。SSR位点查询发现,在14 270条unigene中共可找到15 925个SSR位点。结论:本研究在转录组水平对女贞果实进行了系统研究,这为进一步开展女贞果实的分子标记开发和重要次级代谢产物的生物合成奠定了基础。