非酒精性脂肪性肝炎大鼠TLR4基因及其甲基化水平的相关性研究

目的 观察非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠肝脏中Toll样受体4（TLR4）基因的表达及其甲基化水平的 变化,并探讨两者在NASH发病中的相关性。方法 将20只大鼠采用随机数字表法分为正常组与模型组,每组10 只。正常组与模型组大鼠分别饲喂普通饲料和高脂高糖饲料,于24周后处死。测量大鼠体质量及肝质量,并取各组 大鼠血清及肝脏组织,于低温保存。通过病理染色观察肝细胞的形态变化、脂肪变性及炎性细胞浸润程度。采用酶 联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、三酰甘油（TG）及总胆固醇 （TC）水平;采用免疫组织化学染色法检测肝脏CD68蛋白的表达;采用蛋白免疫印迹法检测肝脏TLR4蛋白的表达; 实时荧光定量PCR检测肝脏TLR4基因mRNA的表达;亚硫酸氢测序PCR（BSP）检测肝脏TLR4基因甲基化水平。结 果 与正常组相比,模型组肝细胞体积增大,出现大量脂肪空泡,炎性细胞浸润明显;肝指数升高,血清中ALT、AST、 TC及TG明显升高（P＜0.01）;CD68蛋白的表达含量明显升高;TLR4蛋白、mRNA表达明显升高（P＜0.01）;甲基化水 平降低（P＜0.01）。TLR4的甲基化水平与其mRNA相对含量的表达呈负相关（P＜0.01）。结论 NASH模型大鼠肝 脏TLR4基因的表达与其甲基化水平呈负相关,TLR4基因甲基化水平的降低在NASH发病因素中发挥重要作用。     

从“脾为生痰之源”探析非酒精性脂肪肝的基本病机

非酒精性脂肪肝已成为全球性疾病。其发生多由过食肥甘厚味、劳逸失度、情志失调、素体痰湿过重等原因,进而影响脾胃的正常功能。脾为生痰之源,而痰湿是非酒精性脂肪肝的重要病理表现。从脾为生痰之源理论探讨非酒精性脂肪肝的发病机制,并通过总结临床运用健脾化痰的方法治疗非酒精性脂肪肝的经验,阐明脾失健运,痰湿内阻为非酒精性脂肪肝的关键病机,为临床运用健脾化痰的方法治疗非酒精性脂肪肝提供理论依据。     

自身免疫性肝炎小鼠模型差异表达基因的筛查及柴胡皂苷D对部分差异表达基因表达的影响

目的对自身免疫性肝炎(AIH)小鼠模型的差异表达基因进行基因芯片筛查,并观察柴胡皂苷D(SS-d)对部分差异表达基因表达的影响,探讨AIH的发病机制及SS-d对该病的治疗作用机制。方法健康、雌性SPF级C57BL/6小鼠40只[体质量(20±2)g],分为基因芯片组(n=8)和SS-d治疗组(n=32)。基因芯片组小鼠又分为正常对照组(n=4)和模型组(n=4),正常对照组常规饲养,模型组小鼠按15 mg/kg剂量给予尾静脉注射刀豆蛋白A(Con A),12 h后处死并提取肝组织,按Agilent芯片说明书进行差异表达基因的筛选,采用荧光定量PCR技术对部分差异表达基因进行验证。SS-d治疗组小鼠随机分为正常组(常规饲养)、模型组(按15 mg/kg剂量给予尾静脉注射Con A)、SS-d低剂量组和SS-d高剂量组(分别按2.5 mg/kg和5.0 mg/kg剂量给予腹腔注射SS-d预处理,8 h后按15 mg/kg剂量给予尾静脉注射Con A)(每组8只)。12 h后收集各组小鼠静脉血,ELISA法检测血清ALT、AST。无菌条件下提取小鼠肝组织,部分多聚甲醛固定后切片,并进行HE染色;部分肝组织用于提取RNA,采用荧光定量PCR技术检测部分差异表达基因(IFNγ、IL-4、IL-5、IL-13和IL-17)的mRNA水平变化。多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t法检验;两组间比较采用t检验。结果基因芯片组小鼠共筛查差异表达基因11512个,其中上调5189个,下调6323个,显著富集于138条信号通路;荧光定量PCR验证结果显示,与正常对照组比较,模型组小鼠IFNγmRNA和IL-17 mRNA的表达升高(P值均<0.01),而IL-4 mRNA、IL-5 mRNA和IL-13 mRNA的表达下调(P值均<0.01),与芯片筛查结果一致。在SS-d治疗组中,与正常对照组比较,模型组小鼠血清ALT、AST水平均升高(P值均<0.01);肝组织内可见大量淋巴细胞浸润;IFNγmRNA和IL-17 mRNA的表达水平明显升高(P值均<0.05),而IL-4 mRNA、IL-5 mRNA和IL-13 mRNA的表达水平明显降低(P值均<0.05)。与模型组比较,SS-d低剂量组和SS-d高剂量组小鼠血清ALT、AST水平均降低(P值均<0.05),肝组织内淋巴细胞浸润程度减轻;IFNγmRNA和IL-17 mRNA的表达水平均降低(P值均<0.05),IL-4 mRNA、IL-5 mRNA和IL-13 mRNA的表达水平均升高(P值均<0.05),上述基因的含量变化差异在SS-d高剂量组与SS-d低剂量组之间具有统计学意义(P<0.05)。结论AIH的发生发展系大量基因异常表达的共同作用结果。其中IFNγ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17与AIH的发病密切相关,同时也是SS-d发挥免疫调节及肝损伤保护作用的生物学靶点。