广州地区携带blaCTX-M-15流行质粒的分子特征研究

目的 研究广州地区携带blaCTX-M-15质粒的分子特征.方法 以2007年到2008年期间来源于广州9家医院确证产CTX-M-15 ESBL的38株大肠埃希菌和47株肺炎克雷伯菌为研究对象,脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)法检测blaCTX-M-15阳性株的同源性,MIC法检测菌株对常用抗生素的敏感性.血清凝集试验确定大肠埃希菌血清型.接合试验了解携带blaCTX-M-15质粒的可接合性,限制性内切酶分析质粒的同源性.PCR分析大肠埃希菌的系统发育群,流行质粒的不相容群和耐药基因构成.结果 blaCTX-M-15阳性的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分别用PFGE确定为28个和30个基因型.携blaCTX-M-15大肠埃希菌的系统发育群以D群(67.8%)和A群(21.4%)为主.大肠埃希菌血清型呈散在分布,未发现O25:H4血清型.大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的ST型无明显集中趋势,大肠埃希菌中发现非O25血清型的ST131,肺炎克雷伯菌中发现2个新的tonB基因和2个新的ST型.58个独立克隆的代表菌株中有40株可将携blaCTX-M-15的质粒传递给受体菌E.coli C600(Rif),其中大肠埃希菌有19株,肺炎克雷伯菌有21株.57.9%(11/19)的大肠埃希菌中携带blaCTX-M-15的质粒大小为65 kb,85.7%(18/21)的肺炎克雷伯菌中携带blaCTX-M-15的质粒大小为92 kb.限制性内切酶分析显示,这2种质粒属流行质粒,分别命名为p15-e和p15-k.通过PCR调查,p15-e存在blaCTX-M-15和ISEcpI;p15-k上存在blaCTX-M-15、ISEcpI、aac(6')-Ⅰ b、aac(3')-Ⅲ、blaOXA-1、qnrB、qnrS、blaDHA-1、blaTEM-1.p15-k同时被证实属于质粒不相容群FⅡ群.结论 广州地区存在携带blaCTX-M-15流行质粒的传播,且流行质粒的大小和基因结构与国外报道不同;无克隆株传播证据.

Abstract：

Objective To study the molecular characteristic of the epidemic plasmids carrying blaCTX-M-15 in Guangzhou. Methods A total of 38 strains of E. coli and 47 strains of K. pneumoniae both producing CTX-M-15 ESBLs were collected from nine hospitals in Guangzhou from 2007 to 2008. The clonal relationship of isolates carrying blaCTX-M-15 was determined by PFGE and MLST. Antimicrobial susceptibility was determined by microdilution test for all isolates. Conjugative plasmids carrying blaCTX-M-15 were obtained by mating and were subject to restriction analysis. PCR was used to determine phylogenetic groups of E. coli,and to study replicon type and the genetic contexts of the plasmids harboring blaCTX-M-15. Serum agglutination test was used to detect the serotype of E. coli. Results The 37 strains of E. coli were classified into 28 genotypes, while the 47 strains of K. pneumoniae were divided into 30 genotypes. ST131 was found in E. coli but not O25 serotype. Two novel-alleles of tonB and new ST were determined in K. pneumoniae. Forty out of 58 isolates represented independent genotypes have been succeeded to transfer the plasmid carrying blaCTX-M-15 to the E. coli C600(Rif) by conjugation. The sizes of plasmids carrying blaCTX-M-15 are 65 kb in 57.9% isolates of E. coli and 92 kb in 87.5% isolates of K. pneumoniae. Two epidemic plasmids were detected in E.coli and K. pneumoniae by restriction enzyme, designated p15-e and p15-k respectively. The blaCTX-M-15 and ISEcpI were identified on p15-e, and the blaCTX-M-15 ,ISEcpI,aac(6')- Ⅰ b,aac(3')-Ⅲ ,blaOXA-1 ,qnrB,qnrS,blaDHA-1 , blaTEM-1 were determined on p15-k. The p15-k also was identified to belong to the incompatible group FⅡ. Conclusion The local dissemination of blaCTX-M-15 appears to be due to the spread of epidemic plasmids harboring blaCTX-M-15. No evidence supports the dissemination of clone strains which carried blaCTX-M-15.     

铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统相关毒力基因的临床意义

目的 了解铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统(TTSS)的毒力基因exo U、exo S的临床意义.方法 来自5家医院临床分离的铜绿假单胞菌189株,采用PCR调查毒力基因exo U、exo S在铜绿假单胞菌中的发生率;微量稀释法测定抗菌药物对细菌的MIC;对携带exo U+/exo S-型或exo U-/exo S+型细菌(从痰液分离)的60例阳性患者资料进行回顾性分析,观察患者临床特征和转归情况.对数据进行x2检验. 结果 PCR检测显示,161株携带TTSS,其中120株exo U-/exo S+,31株exo U+/exo S-,3株exo U+/exo S+,7株exo U-/exo S-;剩余28株为TTSS阴性.痰液标本和血液标本均以exo U-/exo S+表型最常见,分别占其TTSS阳性菌株的72.0%(72/100)和81.5%(44/54).药物敏感试验分析,TTSS阴性菌株对头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、阿米卡星、头孢吡肟的耐药性均高于TTSS阳性菌株(x2值分别为10.1、16.1、9.3、33.8,P值均小于0.01).exo U+/exo S-菌株和exo U-/exo S+菌株的药物敏感试验结果 相似(x2值为0.08～2.04,P值均大于0.05).回顾性分析表明,exo U+/exo S-型患者临床特征是多有气管插管史、ICU住院史、抗感染治疗多采用联合用药,以铜绿假单胞菌感染居多;exo U-/exo S+的临床特征是多存在肺部基础疾病,预后好于前者,以铜绿假单胞菌定植居多. 结论 TTSS存在于大多铜绿假单胞菌临床菌株中,检查痰液标本来源的铜绿假单胞菌exo U或exo S基因,对分析患者临床特征和治疗转归有一定指导意义.     

铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统毒力相关蛋白的差异表达

目的 分析铜绿假单胞菌在耐药性变化时菌株Ⅲ型分泌系统(T3SS)毒力相关蛋白的表达差异,结合患者的临床资料,探讨耐药性变化与细菌毒力变化的相关性.方法 筛选源于同一患者呼吸道、多次分离、药敏谱发生动态改变的铜绿假单胞菌,用肠杆菌基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)方法确定菌株的同源性,以同一克隆的菌株体系为研究对象,Kirby-Bauer纸片法检测菌株对药物的敏感性,PCR方法检测T3SS系统和菌株的毒力基因型,双向蛋白电泳比较菌株的全菌蛋白表达谱,质谱分析差异蛋白点,并在蛋白质数据库进行检索.收集患者临床信息,了解临床特征、细菌耐药性、毒力相关蛋白三者间的关系.结果 筛选出1例慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)合并肺炎的患者符合入选条件,其1年内3次呼吸道分离出铜绿假单胞菌,药敏谱依次为:敏感→多重耐药(MDR)→泛耐药(PDR).3株菌株毒力基因属exo U+/exo S-型,经ERIC-PCR证实为同一克隆.双向凝胶电泳显示3株菌有21个差异表达蛋白.质谱分析发现其中11个蛋白功能明确(9个与细菌基础代谢有关).仅毒力相关蛋白二硫化物氧化还原酶A(DsbA)在PDR株时表达明显上调,在敏感株表达最低.临床信息显示该患者在分离出PDR时,肺部感染最重,并于1个月后死亡.结论 在长期定植、感染过程中,生存环境的变化可能导致铜绿假单胞菌的耐药表型发生变化,同时菌株毒力加强,共同导致感染难于控制.DsbA在铜绿假单胞菌毒力变化中可能发挥了重要的作用.     

哌拉西林/舒巴坦对非发酵菌体外抗菌活性研究

目的 评价哌拉西林/舒巴坦对非发酵菌体外抗菌活性.方法 采用微量肉汤稀释法测定哌拉西林/舒巴坦对细菌的体外抗菌作用.结果 北京、天津、广州、哈尔滨和重庆5个城市的8家医院共收集菌株809株.对于所有铜绿假单胞菌,在8种测试药物中,哌拉西林/舒巴坦的敏感率最高(71.9%),而亚胺培南、头孢吡肟、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦敏感率都低于50%.对于亚胺培南不敏感的铜绿假单胞菌,哌拉两林/舒巴坦敏感率仍可达55.8%.对于碳青霉烯敏感的鲍曼不动杆菌,哌拉西林/舒巴坦和头孢哌酮/舒巴坦敏感率最高,分别为71.0%和73.0%.对于嗜麦芽寡养单胞菌,26%和20%的菌株对哌拉西林/舒巴坦和哌拉两林/三唑巴坦的MIC≤16μg/mL.对于洋葱伯克霍尔德菌,69%的菌株对哌拉两林/舒巴坦的MIC≤16μg/mL.对于黄杆菌属和产碱杆菌属,哌拉西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/三唑巴坦3种酶抑制剂复合制剂敏感率最高,分别为70.2%、63.2%、57.9%和94.4%、94.4%、91.7%.结论 哌拉西林/舒巴坦对于多种非发酵菌具有良好的体外抗菌活性.对碳青霉烯不敏感的铜绿假单胞菌具备一定的抗菌优势,哌拉西林/舒巴坦是经验性治疗非发酵菌感染(包括复数菌感染)的的适宜选用药物之一.     

广州地区产IMP-9金属酶铜绿假单胞菌的再调查

目的 调查广州地区部分医院2007年10月到2008年11月的铜绿假单胞菌泛耐株,筛榆出其中产IMP-9金属酶的菌株并分析其同源性,对比2005-2007年初广州地区多家医院曾出现的产IMP-9金属酶铜绿假单胞菌的克隆株,分析近期广州地区是否还有该流行株的存在.方法 Q-PCR筛选产IMP-9金属酶的铜绿假单胞菌,ERIC-PCR对产酶株进行同源性分析.结果 从2007年10月到2008年11月收集广州7家大型医院的269株铜绿假单胞菌泛耐株,共检测出携带IMP-9金属酶的铜绿假单胞菌10株,均来自同一医院.ERIC-PCR检测,10株均为同一基因型的克隆株,但与前期曾出现的产IMP-9金属酶克隆株无同源性.结论 产IMP-9金属酶铜绿假单胞菌的院内克隆传播仍然存在,而医院间的传播在本次调查中没有发现.因此,仍需继续加强对铜绿假单胞菌定植患者的监控和加强院内感染的管理控制.     

产NDM-1肠杆菌科细菌的耐药机制和临床特征

目的 探讨临床分离的产NDM-1肠杆菌科细菌的耐药机制及携带blaNDM-1质粒的特征和基因环境.方法 连续收集2011年8月至2013年1月华南地区6家综合性医院临床非重复分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌48株,同时选择大肠埃希菌J53作为接合试验受体菌.对所有菌株进行碳青霉烯水解酶表型试验(改良Hodge试验),用PCR法检测碳青霉烯类水解酶相关基因.通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)观察携带blaNDM-1质粒的大小,通过对质粒进行酶切分析质粒的同源性及不相容群分型,并对临床上产NDM-1细菌感染患者的临床特征进行分析.结果 48株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌中有43株改良Hodge试验阳性.碳青霉烯酶耐药基因检测结果示,48株肠杆菌科细菌bla VIM、blaGIM和blaSPM均为阴性,19株细菌blaNDM-1基因为阳性,分别为3株大肠埃希菌、5株肺炎克雷伯菌、6株阴沟肠杆菌、3株弗劳地柠檬酸杆菌、1株产酸克雷伯菌和1株雷氏普罗威登斯菌.药敏试验结果显示,19株细菌均对亚胺培南、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南和哌拉西林/他唑巴坦耐药,对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均为47.3％,但对阿米卡星的敏感率为68.4％.有13株产blaNDM-1细菌携带的blaNDM-1质粒均成功转移到大肠埃希菌J53中.接合子药敏试验结果显示,对亚胺培南、头孢他啶、头孢噻肟和哌拉西林/他唑巴坦仍耐药,但对阿米卡星、环丙沙星和左氧氟沙星均敏感.基因环境结果显示,接合子J-FR90(雷氏普罗威登斯菌)所有基因为阴性,其余12株细菌携blaNDM-1质粒blaSHV、aac-(6')-Ib基因均为阳性.PFGE显示,携blaNDM-1质粒大小基本一致,为50 kb左右.质粒之间有相似的酶切图谱,其相似度＞80％.质粒不相容群为IncX3型.菌株传代500代后,PCR检测显示所携带的blaNDM-1质粒均未丢失.19例产NDM-1细菌感染患者中6例死亡,13例存活.结论 华南地区已出现产NDM-1的肠杆菌科细菌,主要通过IncX3型质粒在肠杆菌中传播.感染此类细菌的患者预后良好.     

卫生部全国细菌耐药监测网2010年广东地区细菌耐药监测

目的 总结2010年广东地区细菌耐药性监测网所属25所医院临床分离株的耐药情况,明确广东地区的耐药特点.方法 各单位采用纸片扩散法和MIC检测方法对48365株临床分离株作药敏试验,并以CLSI 2010年标准判断结果.结果 48365株细菌中革兰阳性菌占42.1％,革兰阴性菌占57.9％.耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐苯唑西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRSCoN)的检出率分别为57.2％和81.9％.未发现万古霉素中介株(VISA)或耐药株(VRSA).肺炎链球菌(非脑膜炎分离株)对青霉素耐药率为0.肠杆菌科细菌对碳青霉烯类保持最低耐药性.对铜绿假单胞菌耐药率最低的依次是妥布霉素(8.8％)、左氧氟沙星(13.4％)和阿米卡星(15.2％).对不动杆菌属耐药率最低的依次是米诺环素(17.3％)和头孢哌酮/舒巴坦(22.8％).结论大肠埃希菌和克雷伯菌属对碳青霉烯类抗生素、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦仍保持高度敏感性.不动杆菌属对碳青霉烯类耐药问题仍需注意.     

2019冠状病毒病患者危重症临床风险评分系统的外部验证

目的 评价2019冠状病毒病(COVID-19)危重症风险预测评分模型对医疗资源充足地区患者的适用性.方法 纳入2020年1月11日—2月22日深圳市第三人民医院COVID-19定点收治医院的病例,并进行严重程度分型.危重症COVID-19患者被定义为入住ICU、有创机械通气或死亡的患者.使用COVID-19危重症风险...