实时荧光定量PCR检测人宫颈癌细胞赖氨酰氧化酶样-4基因的表达

目的:利用实时荧光定量PCR检测赖氨酰氧化酶样-4(Lysyloxidase-like 4,LOXL4)基因在Hela、ME180、HCC94人宫颈癌细胞中的表达情况.方法:提取3株体外培养宫颈癌细胞株的总RNA,逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR扩增,结合内参基因GAPDH及标准曲线比较LOXL4 mRNA在Hela、ME180和HCC94 3株体外培养的人宫颈癌细胞中的表达.结果:LOXL4基因在3株人宫颈癌细胞中均有表达,但表达水平存在统计学差异,以Hela的表达为参照(Ratio=LOXL4/GAPDH=1.00),ME180的表达水平为6.80E-3,HCC94细胞株表达丰度最低为5.62E-4.结论:建立了LOXL4基因在宫颈癌细胞表达的检测平台,为宫颈癌早期诊断及预测预后提供可借鉴的观察指标.     

人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体构建及鉴定

目的构建并鉴定靶向人ERRα基因的小分子干扰RNA的慢病毒载体。方法针对ERRαmRNA设计了4条si RNA,并构建pGCSIL-GFP-siERRα慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定。用pGCSIL-GFP-siERRα、pHelp-er1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将慢病毒干扰RNA及含有ERRα过表达载体共转染293T细胞,Western-blot检测ERRα表达,观察蛋白表达抑制效果。结果 PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达2×109TU/ml。转染细胞中ERRα蛋白表达显著降低。结论成功构建高表达、高效率的人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体,为进一步研究ERRα在细胞核内转导中的作用机制和靶向ERRα治疗奠定基础。     

妇科恶性肿瘤患者细胞免疫功能状态分析

目的探讨妇科恶性肿瘤患者细胞免疫功能状况及其临床意义。方法采用流式细胞术技术检测108例妇科恶性肿瘤患者及17例健康正常人的外周血淋巴细胞亚群,并作比较分析。结果与健康正常人比较,妇科恶性肿瘤患者CD4+T淋巴细胞百分率、NK细胞百分率、CD4+/CD8+比值明显升高(P<0.05),CD3+、CD8+T淋巴细胞百分率明显降低(P<0.05),CD19+(B淋巴细胞)在两组间比较的差异无统计学意义(P>0.05)。结论妇科恶性肿瘤患者存在免疫功能紊乱,外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞检测可作为细胞免疫功能的指标之一。     

光敏剂五聚赖氨酸-β-羰基酞菁锌对宫颈癌Hela细胞的光动力学治疗研究

目的 研究光敏剂五聚赖氨酸-β-羰基酞菁锌”[ZnPc-(Lys)5]光动力诱导宫颈癌Hela细胞死亡的方式.方法 测量Hela细胞对光敏剂ZnPc-(Lys)5的摄取、光毒性和暗毒性,利用流式细胞仪分析光动力疗法对Hela细胞的影响,包括其细胞凋亡和细胞坏死的比例;并通过透射电镜观察细胞超微结构的改变情况.结果 Hela细胞对该光敏剂的摄取随着ZnPc-(Lys)5浓度的升高而增强,相关光动力学实验结果显示:光敏剂ZnPc-(Lys)5对宫颈癌Hela细胞的光动力疗效作用理想,无暗毒性.其介导的光动力治疗是通过诱导细胞凋亡途径而达到消灭肿瘤细胞的作用.ZnPc-(Lys)5对Hela细胞光动力作用后随作用的不同时间,其凋亡的比率有显著性差异:0.5h的早期凋亡率为(50.36±1.02)％,1h为(40.80±0.72)％,2h为(30.87±2.80)％,4h为(26.87±0.81)％,各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).晚期凋亡率0.5h为(34.23±0.55)％,1h为(33.97±1.40)％,2h为(45.57±1.12)％,4h为(45.57±1.22)％,第0.5h、1h与第2h、4h比较,差异有统计学意义(P＜0.05).Hela细胞在光动力作用下1h超微结构主要表现为早期凋亡,2h后超微结构改变为晚期凋亡和胀亡的特征改变.结论 光敏剂ZnPc-(Lys)5介导的光动力治疗主要通过凋亡途径特异性诱导宫颈癌Hela细胞的死亡.     

HPLC法测定宫颈癌患者血浆顺铂浓度的研究

目的建立一种便捷、准确测定宫颈癌化疗患者血浆中顺铂(Cisplatin,DDP)浓度的高效液相色谱测定法(HPLC),为实时监测血浆顺铂浓度及制定化疗方案提供实验依据。方法取500μL待检者血浆,先将血浆样本经甲醇沉淀蛋白,取上清液经二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC)衍生,再由三氯甲烷萃取。色谱柱为Ultimate Acclaim120C18(5μm,4.6mm×250mm),流动相为甲醇∶水=75∶25;流速为1.0mL/min;紫外检测波长为254nm;柱温35℃;进样量20μL。结果血浆顺铂浓度检测的线性范围为0.2~10mg/L(r=0.9995),最低检测限为0.057mg/L(S/N=3),相对回收率为100.8%±3.6%,日内和日间RSD均10%。结论该方法处理过程简便、快速,重复性好,可用于宫颈癌化疗患者血浆顺铂浓度测定和顺铂药物动力学研究。     

顺铂对人子宫内膜癌RL-952细胞系Matriptase,uPA-mRNA表达的影响

目的探讨顺铂对人子宫内膜癌RL-952细胞系Matriptase,uPA-mRNA表达的影响。方法体外培养人子宫内膜癌RL-952细胞,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测顺铂对人子宫内膜癌RL-952细胞Matriptase,uPA-mRNA表达的影响。结果 Matriptase,uPA-mRNA在人子宫内膜癌RL-952细胞系呈阳性表达。顺铂可下调Matriptase,uPA-mRNA在人子宫内膜癌RL-952细胞系的表达,具有浓度依赖性。8mg/L顺铂溶液作用不同时间后,4h后RL-952细胞Matriptase-mRNA表达量即明显下降(P0.05),而uPA-mRNA表达量于作用8h后才开始下降(P0.05),具有时间依赖性。结论顺铂可抑制人子宫内膜癌RL-952细胞系Matriptase,uPA-mRNA的表达,并具有浓度依赖性。8 mg/L的顺铂作用于人子宫内膜癌RL-952细胞后,Matriptase-mRNA比uPA-mRNA更早出现表达下调的变化。     

两种不同人乳头瘤病毒检测方法对子宫颈上皮内病变筛查价值的比较

目的比较酶切信号放大法高危型HPV检测(enzyme digestion signal amplification method in detection of HR-HPV,称为Cervista法)和PCR反向点杂交法HPV检测(PCR-RDB)对宫颈病变的筛查价值。方法从宫颈癌筛查患者中选取319例宫颈液基细胞学检测(TCT)异常(≥ASCUS)和319例同期同年龄段TCT正常患者作为研究对象,并同时进行Cervista、PCR-RDB HPV检测。TCT异常和(或)高危型HPV阳性者均进一步行阴道镜下活检。以病理结果为金标准,比较两种方法结果的一致性、敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值,同时计算宫颈上皮内病变组HPV阳性人数与HPV阴性人数比值和宫颈正常组HPV阳性人数与HPV阴性人数的比值比(OR)。结果两种方法对14种高危型HPV的检测结果一致率85.6%(546/638),KI值为0.708。Cervista诊断低级别宫颈上皮内病变(CIN1)和高级别宫颈上皮内病变(CIN2+)的敏感性分别为85.7%和93.0%,PCR-RDB诊断CIN1和CIN2+的敏感性分别为92.9%和95.5%。Cervista高危型HPV阳性时患CIN1和CIN2+的OR值分别为14.207(95%CI:5.048~39.984)和18.078(95%CI:8.284~39.449),Cervista A9组HPV阳性时患CIN1和CIN2+的OR值分别为15.832(95%CI:5.296~47.327)和32.031(95%CI:14.356~71.470)。PCR-RDB高危型HPV阳性时患CIN1和CIN2+的OR值分别为9.685(95%CI:4.854~19.323)和20.705(95%CI:10.901~39.328),PCR-RDB HPV16阳性时患CIN1和CIN2+的OR值分别为11.909(95%CI:3.768~37.640)和86.864(95%CI:39.087~193.039)。两种HPV检测方法对ASCUS患者发生CIN1和CIN2+的诊断敏感性均分别为86.7%和91.3%。Cervista与TCT联合筛查对CIN1和CIN2+的诊断敏感性分别为99.1%和99.4%,特异性分别为51.5%和45.3%。PCR-RDB与TCT联合筛查对CIN1和CIN2+的诊断敏感性均为100%,特异性分别为38.3%和33.5%。结论两种HPV检测方法结果一致性良好。除PCR-RDB方法对CIN1筛查敏感性略高于Cervista外,两种HPV检测方法对CIN2+的筛查价值相当。     

微小RNA在妇科肿瘤中的研究进展

微小RNA（microRNA,miRNA）是一类在动植物中广泛存在的内源性21~25个核苷酸的短序列、高度保守的小分子非编码RNA。这类分子调节基因的表达,参与细胞分化、增殖和凋亡,肿瘤的发生、DNA甲基化及染色质改变等一系列的重要进程。综述miRNA的生物合成、作用机制及在妇科肿瘤中的一些研究进展。