苯安莎类抗生素的一种早期鉴别方法

目的建立一种对苯安莎类抗生素特异的颜色反应早期鉴别方法。方法根据碱性处理苯安莎类抗生素，使其安莎链与苯环连接的酰胺键开裂后化合物呈紫色的原理，建立了将发酵液粗提品进行薄层色谱层析后采用2．0mol／LNaOH溶液喷涂显色的早期鉴别方法；以格尔德霉素为例，在硅胶板上的检测灵敏度为4μg。结论采用该颜色鉴别反应方法：①对两株确证为新的格尔德霉素产生菌Streptomyces sp．4-4以及Streptomyces sp．3-57进行了佐证；②对吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997的一株格尔德霉素生物合成后修饰基因阻断变株CT-1中产生的格尔德霉素前体物及其类似物，在硅胶板上进行了快速定位和初步鉴别。     

Streptomyces sp.4353中3-氨基-5-羟基-苯甲酸（AHBA）合酶基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的 克隆Streptomyces sp.4353中的3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)合酶基因,并将其在大肠埃希菌中表达.方法参与AHBA生物合成的5个基因,即氨基奎尼酸脱水酶基因、氨基奎尼酸/莽草酸脱氢酶基因、AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因通常连锁,形成一个AHBA生物合成基因簇.本文通过分析、比较已知AHBA生物合成基因簇的基因组织结构特点和序列保守性,设计引物,以Streptomyces sp.4353的总DNA为模板,在已知737bp AHBA合酶基因部分序列的基础上,通过PCR扩增其上、下游DNA序列,克隆至pMD18-T载体上,测序、拼接并进行生物信息学分析.以pET24a(+)为表达载体,对克隆得到的AHBA合酶基因在大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中进行表达和SDS-PAGE检测.结果从Streptomyces sp.4353中得到了一段2872bp大小的DNA片段(NCBI GenBank接受号EU734184),其中含有AHBA生物合成基因簇中的AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因(部分);AHBA合酶基因在大肠埃希菌中得到了成功表达,在SDS-PAGE上可见到清晰的、与预计大小(42.7ku)一致的蛋白表达特异条带.结论 Streptomyces sp.4353中的AHBA合酶基因的克隆以及在大肠埃希菌中的表达为进一步研究该基因的功能奠定了基础.本研究克隆得到的2872bp DNA片段还有可能用于AHBA的杂合/异源生物合成,以及安莎类抗生素的组合生物合成.     

具有产生安莎类抗生素潜能的放线菌的分子筛选

目的建立一种高通量筛选具有产生安莎类抗生素潜能的放线菌的分子筛选方法。原理3-氨基-5-羟基-苯甲酸（AHBA）是安莎类抗生素生物合成的前体。在通过氨基莽草酸途径生物合成AHBA的过程中，AHBA合酶是催化5-氨基-3-脱氢-5-脱氧莽草酸形成AHBA的一个特异性关键酶。AHBA合酶基因的存在可以作为放线菌菌株具有合成安莎类抗生素能力的一个必要而非充分的条件。AHBA合酶基因高度保守，通过PCR方法可以建立一种针对AHBA合酶基因存在与否的、具有安莎类抗生素产生潜能的放线菌菌株高通量筛选方法。方法根据已知AHBA合酶序列的相似性，设计了针对AHBA合酶基因中高度保守的一段755bp片段大小的PCR筛选寡核苷酸引物，用于从土壤中分离的未知放线菌高通量筛选。结论从1900株土壤分离的未知放线菌中筛选获得33株AHBA合酶基因阳性菌株，即具有安莎类抗生素产生潜能的放线菌菌株。     

AHBA合酶基因的筛选与放线菌素D产生菌的发现

根据3,5-AHBA合酶基因序列的保守性所设计的简并引物,通过PCR的方法,从20株未知产物放线菌菌株中,获得两个AHBA合酶基因阳性菌株(S.violaceusniger 4353和Streptomyces rochei 4088).同源性分析显示,克隆到的3,5-AHBA合酶与已知的3,5-AHBA合酶蛋白序列有一定的同源性(86%～87%).对其中一株阳性菌株4353(S. violaceusniger 4353)的发酵活性产物进行了化学分离纯化和TLC、HPLC-UV、MS、1H.NMR和13C-NMR等分析结构鉴定,表明其发酵产生的一个活性成分为放线菌素D.基因单交换阻断实验结果证明,4353菌株所产生的放线菌素D确实与3,5-AHBA合酶基因相关.本文对获得这一结果的可能原因进行了讨论.