定志小丸对东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的影响及机制

目的:研究经典古方定志小丸(由石菖蒲、远志、茯苓、人参按2∶2∶3∶3比例组成)对东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的影响及可能的作用机制.方法:将小鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(石衫碱甲0.05 mg·kg-1)、定志小丸高、中、低剂量组(700,350,175 mg·kg-1),连续灌胃7d后,腹腔注射东茛菪碱(1.5 mg · kg-1)制备小鼠学习记忆障碍模型,通过Morris水迷宫试验评价各组小鼠的学习记忆功能,并测定各组小鼠全脑中谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、乙酰胆碱(Ach)含量及乙酰胆碱酯酶(AchE)活性.结果:行为学测试结果表明定志小丸能明显降低模型小鼠在Morris水迷宫定位航行试验中的平均潜伏期,增加空间探索试验中的穿越平台次数、目的象限游泳路程及时间的百分比;增加小鼠脑中Glu,5-HT,DA和Ach含量,降低GABA含量和AchE活性.结论:定志小丸可明显改善东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍,增强小鼠学习记忆的能力,其作用机制可能与调节Glu/GABA系统以及提高脑中Ach和单胺递质含量有关.     

基于CREB通路研究3,6’-二芥子酰基蔗糖的神经保护分子机制

目的 3,6’-二芥子酰基蔗糖(DISS)是远志中的寡糖酯类成分,通过研究DISS对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的增殖作用和对环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)通路的影响,探究其发挥神经保护作用的分子机制。方法采用四甲基噻唑蓝(MTT)法测定SH-SY5Y细胞生长曲线,筛选最佳种板密度和给药时间,并检测不同浓度DISS对细胞增殖的影响;采用Western blotting法检测细胞给予DISS后不同时间点CREB、磷酸化CREB(p-CREB)和脑源性神经生长因子(BDNF)的表达水平;给予调节CREB活性的相关上游通路拮抗剂U0126(MEK拮抗剂)、H89(PKA拮抗剂)、KN93(CaMK拮抗剂)拮抗CREB上游通路,并给予DISS保护,用Western blotting法检测DISS对拮抗前后细胞内CREB,p-CREB,BDNF蛋白表达的影响。结果 SH-SY5Y最佳中板密度为2×108L-1,DISS(60μmol·L-1,30μmol·L-1)对SH-SY5Y细胞具有明显的促增殖作用(P<0.05);与正常细胞相比,DISS给药15 min时可显著增加细胞内p-CREB,BDNF的表达(P<0.05);DISS可明显增加拮抗后SH-SY5Y细胞内CREB,p-CREB,BDNF的表达水平(P<0.05)。结论 DISS可以调节CREB活性并促进下游BDNF等相关因子的表达,其神经保护作用的机制可能与活化Ca2+/CaM/CaMK-CREB-BDNF信号通路有关。     

开心散对5-HT合成、代谢及重摄取的影响

目的中药复方开心散(KXS)抗抑郁作用明显。本文观察KXS对慢性应激大鼠脑匀浆液中色氨酸羟化酶(TPH)、5-羟色氨酸脱羧酶(AADC)、单胺氧化酶(MAO)、5-羟色胺转运体(SERT)等含量或活性的影响,探讨KXS对5-HT合成、代谢及重摄取的作用,明确KXS升高5-羟色胺(5-HT)含量的机制。方法选择Open-filed评分相近的雄性Wistar大鼠,采用孤养结合慢性不可预见性中等强度应激(CUMS)连续刺激3周造模,将CUMS大鼠随机分为模型组,KXS高剂量(676 mg·kg-1)组和KXS低剂量(338 mg·kg-1)组,连续灌胃给药3周,空白组和模型组动物给予生理盐水代替。给药结束后取脑组织匀浆,采用高效液相色谱法检测5-HT和5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的含量,酶联免疫吸附法(ELISA)检测色氨酸(Trp)和AADC的含量,Western blotting法检测TPH和SERT的含量,化学发光法检测脑线粒体MAO-A和MAO-B的活性。结果与模型组相比,KXS 676 mg·kg-1和338 mg·kg-1均能显著升高CUMS大鼠脑匀浆液5-HT的含量(P<0.01);但5-HT的代谢产物5-HIAA的含量没有显著升高,用化学发光法进一步检测了KXS给药3周后大鼠脑线粒体中MAO-A和MAO-B活性的影响,发现KXS组MAO-A和MAO-B的活性无明显降低;Western blotting法检测SERT的含量并对蛋白条带进行灰度分析发现,KXS不能显著升高大鼠脑匀浆液中SERT蛋白的含量;但是,KXS 676 mg·kg-1和338 mg·kg-1均能升高CUMS大鼠脑匀浆液中Trp(P<0.05),AADC(P<0.05)及TPH(P<0.01)蛋白含量。结论开心散对5-HT重摄取和代谢无抑制作用,其可能是通过促进5-HT合成,升高CUMS大鼠脑5-HT含量,进而发挥抗抑郁作用的。     

基于慢病毒介导短发夹状RNA沉默BDNF基因研究开心散的作用机制

目的阐明脑源性神经营养因子(BDNF)在抑郁症发病中的分子机制以及经典复方开心散对RNA干扰(RNAi)沉默BDNF基因后的影响作用及分子机制。方法体外构建四条能表达针对BDNF外显子的shRNA干扰序列的慢病毒载体,将这四条慢病毒载体转染入自然表达BDNF的大鼠神经胶质瘤细胞(C6)中,通过qPCR和Western Blot筛选出BDNF基因敲减的最佳慢病毒干扰序列。将体外验证的慢病毒载体或阴性对照载体微量注射到SD大鼠双侧海马齿状回区,通过一系列行为学方法评价该模型,并研究开心散对其影响及作用机制。结果在C6细胞水平上,LVshBDNF-3的干扰作用最显著,有效敲减率达81%。在体内实验中有效沉默BDNF基因的最佳试验时间为10～33 d。微量注射慢病毒干扰载体10 d后,海马BDNF蛋白表达出现了显著的降低,同时糖水偏嗜度,open field评分水平活动和垂直活动均明显减少,而开心散能促进海马DG区BDNF沉默大鼠的体重增加和糖水摄入,显著提高水平运动和垂直运动得分,增加海马BDNF表达。Morris水迷宫实验显示沉默海马DG区BDNF基因能导致大鼠空间学习能力的显著下降,但其并不能减低大鼠的记忆能力;开心散能够明显修复RNAi所致的DG区BDNF沉默大鼠获得性学习能力的损伤,但对大鼠空间记忆的保留方面的损伤没有观察到明显的修复作用。结论海马BDNF表达与抑郁症呈负关联关系,内源性BDNF的减少能导致抑郁症的发生。开心散能够明显拮抗LVsh-BDNF-3沉默所致的低表达的海马BDNF水平,从而发挥抗抑郁作用并改善学习障碍。     

胞外信号调控激酶（ERK）信号通路与抑郁症

胞外信号调控激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）信号通路对神经细胞的生长、增殖、分化和存活起关键调节作用,并且对脑内突触可塑性和学习记忆有重要影响,因此ERK信号通路逐渐成为抗抑郁机制的研究热点。本文综述了近年来ERK信号通路在抑郁症发生和治疗方面的作用和机制,供同行参考。     

肝胆两益汤镇静促眠作用研究

目的探究《辨证录》·肝胆两益汤的镇静促眠作用,为研发镇静促眠新药提供实验依据。方法小鼠分别灌胃给予肝胆两益汤(水提冻干粉)2500,1250和625 mg·kg-1.d-1,连续灌胃给药1周,用小鼠自主活动仪观察其对小鼠自主活动的影响;以腹腔注射戊巴比妥钠方法,观察肝胆两益汤对阈剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡潜伏期和睡眠持续时间的影响及其对戊巴比妥钠阈下剂量致小鼠入睡率的影响。结果与正常组相比,肝胆两益汤2500 mg·kg-1.d-1和1250 mg·kg-1.d-1均可显著减少小鼠自主活动次数(P<0.01)并且能够显著缩短阈剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡潜伏期(P<0.01)和显著延长小鼠睡眠持续时间(P<0.05,P<0.01),阈下剂量戊巴比妥钠试验显示,1250 mg·kg-1.d-1组可明显提高阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡率(P<0.01)。结论肝胆两益汤2500 mg·kg-1.d-1和1250 mg·kg-1.d-1剂量对小鼠具有显著的镇静促眠作用。     

远志寡糖酯A对C6细胞MAPK/ERK信号通路的影响

目的探究远志寡糖酯A(tenuifoliside A)对大鼠胶质瘤细胞(C6细胞)的神经营养作用及可能机制。方法远志寡糖酯A 60,30,10,6,3和0.6μmol·L-1处理C6细胞24 h,MTT法检测检测细胞存活率;远志寡糖酯A 10μmol·L-1处理C6细胞0,5,10,15,30,45,60,120 min,Western blotting测定C6细胞中p-ERK,ERK,BDNF的表达水平;选取各有效剂量分别处理C6细胞24 h,蛋白免疫印记法测定C6细胞中BDNF的表达水平;用ERK1/2特异性拮抗剂U0126 10μmol·L-1预处理C6细胞30 min,再用远志寡糖酯A 10μmol·L-1处理15 min,Western blotting检测p-ERK,ERK,BDNF的表达水平。结果与正常组细胞相比,30,10,6和3μmol·L-1剂量能促进C6细胞增殖,60μmol·L-1剂量对C6细胞有抑制作用,远志寡糖酯A 0.6μmol·L-1剂量对细胞增殖作用不明显;远志寡糖酯A诱导C6细胞中ERK1/2磷酸化具有时效性,在5 min起效,15 min时ERK1/2磷酸化水平达到最高峰,1 h后回落;不同浓度的远志寡糖酯A促C6细胞内BD-NF表达呈剂量依赖性;和溶剂组相比,ERK1/2拮抗剂处理组的p-ERK,ERK,BDNF的表达水平显著降低。结论远志寡糖酯A对大鼠胶质瘤细胞有促增殖作用,其机制可能与激活MAPK/ERK通路,磷酸化ERK1/2,进而促进CREB磷酸化,最终促进BDNF表达有关。     

Tenuifoliside A基于ERK通路保护皮质酮损伤C6细胞作用研究

目的探讨远志寡糖酯成分Tenuifoliside A(TFSA)对皮质酮诱导大鼠神经胶质瘤细胞(C6)损伤的保护作用及其分子机制。方法建立以0.8 mmol.L-1的皮质酮作用于C6细胞48h的损伤模型;用皮质酮预处理C6细胞30 min后加入30、10和3μmol.L-1的TFSA,共同作用48 h,CCK试剂盒检测TFSA对皮质酮诱导C6细胞损伤的存活率;荧光显微镜观察C6细胞Hoechst 33258染核后凋亡形态变化;Western blot检测C6细胞内ERK及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达;Caspase检测试剂盒检测C6细胞内Caspase激酶活力的变化。结果与正常对照组比,0.8 mmol.L-1的皮质酮对C6细胞有明显的损伤作用,其细胞存活率降低至69.58%(与正常组相比,P<0.01);细胞核形态改变,出现凋亡小体;胞内ERK蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2表达量明显降低(与正常组相比,P<0.01),Caspase-3激酶的活力增加(P<0.01)。与模型组相比,各剂量组的TFSA均有不同程度对抗皮质酮损伤的作用,细胞存活率明显提高至84.48%(与模型组相比,P<0.01),同时细胞核形态有明显改善;细胞内的ERK蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2表达量明显增加(P<0.01);Caspase-3激酶活力明显降低。结论 TFSA对皮质酮诱导损伤的C6细胞具有保护作用,其机制可能与TFSA能激活C6细胞内ERK通路,提高抗凋亡蛋白Bcl-2表达,降低Caspase-3激酶活性有关。     

走马胎中皂苷成分AG4对MCF-7肿瘤细胞增殖的影响及机制研究

目的研究走马胎皂苷成分AG4对不同肿瘤细胞株增殖的影响,检测其对MCF-7细胞凋亡、细胞周期、Caspase-3和Caspase-9的活性、以及SOD活性和GSH、MDA含量的影响。方法终浓度为0.51～8.13μmol.L-1的AG4作用于肿瘤细胞株24～72 h后,采用MTT比色法检测AG4对9种肿瘤细胞株增殖的影响;筛选出对AG4敏感的细胞株,Hoechst染色观察细胞形态学变化;采用流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化;采用相应试剂盒分别进行SOD活性和GSH、MDA含量的测定;采用Caspase-3和Caspase-9活性检测试剂盒对Caspase-3和Caspase-9活性进行检测。结果AG4作用于A549、BeL-7402、BGC-823、C6、EJ、HeLa、HepG2、MCF-7、LS180细胞24 h、48 h和72 h的IC50为3.67～11.1μmol.L-1,其中MCF-7细胞株对AG4较为敏感,24 h、48 h和72 h的IC50值分别为(3.67±0.61)、(3.76±0.66)和(4.03±0.47)μmol.L-1。高、中两剂量的AG4作用MCF-7细胞24 h后,细胞凋亡形态明显,发生早期凋亡;细胞阻滞在S期;SOD活性和GSH含量降低,MDA含量明显升高;Caspase-3和Caspase-9的活性均明显高于正常对照组。结论AG4对MCF-7细胞的增殖抑制作用最为明显。AG4干预MCF-7细胞内的氧化还原系统、阻滞周期并通过激活线粒体凋亡信号转导通路来诱导细胞凋亡。