人羊膜上皮细胞培养液抑制角膜新生血管的实验研究

背景 角膜新生血管(CNV)是一种常见的眼部病变,研究其发病机制及其抑制剂是眼科研究的热点和难点. 目的 研究人羊膜上皮细胞(AECs)培养液对CNV的抑制作用及机制. 方法 消化法培养及鉴定人AECs,并收集培养液,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测色素上皮衍生因子(PEDF)和白细胞介素1受体拮抗剂( IL-1Ra)在培养液中的质量浓度.兔角膜上皮细胞分离后分别用无血清DMEM培养基、人AECs培养液、混合培养液(DMEM+人AECs培养液)培养48 h,采用实时定量聚合酶链反应(QRT-PCR)法检测不同培养液培养的角膜上皮细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达.用含质量分数10％胎牛血清的DMEM培养基培养人脐静脉血管内皮细胞(UVECs),并分别加入无血清DMEM、混合培养液和人AECs培养液,划痕法和细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测各组培养液对人UVECs迁移的影响.分别在上述3种培养基中加入终质量浓度为50 μg/L的bFGF,CCK8法检测各培养液中人UVECs的增牛情况.在原子力显微镜(AFM)下观察人AECs培养液对人UVECs超微结构的影响. 结果 人羊膜培养和传代细胞角蛋白免疫组织化学染色阳性证实为人AECs.与无血清DMEM组相比,人AECs培养液组的兔角膜上皮细胞VEGF mRNA(1.00±0.22 vs.2.98±0.46)及bFGF mRNA( 1.00±0.36vs.2.55±0.48)的表达均明显下降,差异均有统计学意义(P=0.001、0.002);培养后不同时间人AECs培养液组人UVECs的增生吸光度(A)值明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05),人UVECs的迁移率下降,差异有统计学意义(P＜0.05).AFM观察见人AECs培养液组的血管内皮细胞膜粗糙、表面颗粒紊乱,细胞间连接及伪足减少.ELISA法检测人AECs培养液中PEDF的质量浓度为(70.41 ±0.68) μg/L,IL-1Ra的质量浓度为(153.56±0.36) ng/L,无血清DMEM组中未检出.结论 人AECs培养液可抑制角膜上皮VEGF及bFGF的表达,抑制血管内皮细胞的增生和迁移,细胞结构和功能改变,这可能是其抑制CNV的机制之一.     

丝裂霉素C对翼状胬肉成纤维细胞膜通透性及超微结构的影响

背景 丝裂霉素C(MMC)对人翼状胬肉成纤维细胞的生长和增生有明显的抑制作用,但关于其对细胞膜影响的研究很少. 目的 探讨MMC对翼状胬肉成纤维细胞膜理化特性及超微结构改变的干预.方法 收集翼状胬肉手术切除标本15例,用组织块培养法培养人成纤维细胞,以波形蛋白免疫组织化学染色法对培养细胞进行鉴定.取传3代后对数生长期细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板,将不同质量浓度0、50、100、200、300、400 mg/L MMC加入培养孔中处理翼状胬肉成纤维细胞12h,用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测培养细胞的活力,应用Annexin V-FICT/碘化丙啶(PI)法检测细胞凋亡的情况;利用原子力显微镜(AFM)观察不同质量浓度MMC作用后人成纤维细胞膜超微结构的改变;检测细胞上清液中丙二醛( MDA)的浓度以评价细胞的脂质过氧化程度;检测细胞外液中漏出的乳酸脱氢酶(LDH)含量以评估细胞膜的通透性变化;用Fluo-3/AM标记和流式细胞术检测培养细胞内游离钙离子的变化. 结果 组织块法原代培养贴壁1～2周可见大量长梭形细胞爬出,波形蛋白检测呈阳性反应.用MMC处理培养细胞12h后,人成纤维细胞的活力减弱,MMC对细胞增生的抑制作用呈剂量依赖性.0、50、100、200、300 mg/L MMC处理组细胞凋亡百分比分别为4.2％、4.2％、5.4％、19.3％和25.8％.AFM下可见不同质量浓度MMC作用后人成纤维细胞膜超微结构的异常,不同质量浓度MMC处理组细胞外液中LDH活性及细胞上清液中MDA浓度明显高于对照组,且均随着MMC质量浓度的增加,LDH活性及细胞上清液中MDA浓度逐渐增加,组间两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).Fluo-3/AM标记和流式细胞术检测表明,培养细胞内游离钙离子增多.结论 MMC能引起翼状胬肉成纤维细胞膜的理化性质改变,其作用呈剂量依赖性,细胞膜是其药效和毒性的作用靶点之一.     

原发性急性闭角型青光眼合并白内障患者超声乳化术后眼前节的变化

目的　采用超声生物显微镜（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄｂｉｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ,ＵＢＭ）和眼前节光学相干断层扫描仪（ｏｐｔｉｃａｌｃｏｈｅｒｅｎｃｅｔｏｍｏ-ｇｒａｐｈｙ,ＯＣＴ）２种检测方法观察原发性急性闭角型青光眼合并白内障患者行超声乳化手术前后的眼前节解剖结构变化,评估这２种检查方法的应用价值。方法　对３５例３５眼原发性急性闭角型青光眼合并白内障患者行超声乳化白内障摘出联合人工晶状体植入术,监测术前及术后最佳矫正视力（ｂｅｓｔｃｏｒｒｅｃｔｅｄｖｉｓｕａｌａｃｕｉｔｙ,ＢＶＣＡ）及眼压,于术前、术后３个月分别用ＵＢＭ及ＶｉｓａｎｔｅＯＣＴ对眼前节进行生物学测量,分析术前术后眼前节参数的变化,并比较２种检测方法的差异。结果　所有患者术后１周、１个月、３个月眼压分别为（１３．８５±５．０６）ｍｍＨｇ（１ｋＰａ＝７．５ｍｍＨｇ）、（１３．２９±４．５５）ｍｍＨｇ、（１３．４７±４．１１）ｍｍＨｇ,与术前（（１７．０７±４０２）ｍｍＨｇ相比均显著降低并保持平稳,术后１周、１个月、３个月ＢＣＶＡ分别为０．５１±０．１０、０．６５±０．２１、０．６３±０１９,与术前（０．２０±０．１０）相比均显著提高。眼压和ＢＣＶＡ术前、术后的差异均有统计学意义（Ｆ＝９．３３,Ｐ＝０．０００;Ｆ＝１０６２７,Ｐ＝０．０００）。ＵＢＭ和ＶｉｓａｎｔｅＯＣＴ术后检测中央前房深度（ａｎｔｅｒｉｏｒｃｈａｍｂｅｒｄｅｐｔｈ,ＡＣＤ）分别为（３．４１±０．４４）ｍｍ、（３．４５±０．３９）ｍｍ,与术前分别为（１．９３±０．２８）ｍｍ、（１．９５±０．３２）ｍｍ相比明显加深,差异具有统计学意义（ｔ＝－１２．１４２,ｔ＝－１２．０８７,均为Ｐ＝０．０００）,２种检测方法之间相比差异无统计学意义（ｔ＝０．１４３,Ｐ＝０．８９０;ｔ＝－０．１９７,Ｐ＝０．８２４）。ＵＢＭ和ＶｉｓａｎｔｅＯＣＴ检测术后房角开放距离ＡＯＤ５００分别为（０．３７±０．１６）ｍｍ、（０．２９±０．１１）ｍｍ,与术前分别为（０．１８±０．１０）ｍｍ、（０．１５±０．０５）ｍｍ相比显著增加,差异具有统计学意义（ｔ＝－１４．５６１,ｔ＝－１３．２３３,均为Ｐ＝０．０００）,２种检测方法之间相比差异具有统计学意义（ｔ＝１．８２５,Ｐ＝０．０４６;ｔ＝－４．０５４,Ｐ＝０．０００）。ＵＢＭ和ＶｉｓａｎｔｅＯＣＴ术后检测小梁虹膜夹角分别为（３６．５５±５．９３）°、（２９．８３±４．８７）°,与术前分别为（１７．８１±５．１７）°、（１２．４４±４．２５）°相比显著增加,差异具有统计学意义（ｔ＝－１３．３２８,ｔ＝－１１．７５１,均为Ｐ＝０．０００）,２种检测方法之间相比差异具有统计学意义（ｔ＝２．０１２,Ｐ＝０．０２９;ｔ＝－３．３８１,Ｐ＝０．０００）。ＵＢＭ和ＶｉｓａｎｔｅＯＣＴ术后检测房角隐窝面积分别为（０．１９±０．１５）ｍｍ２、（０．１２±０．１０）ｍｍ２,与术前分别为（０．０６±０．０４）ｍｍ２、（０．０５±０．０６）ｍｍ２相比明显增加,差异具有统计学意义（ｔ＝－１０．１２２,ｔ＝－９．０８１,均为Ｐ＝０．０００）,２种检测方法之间相比差异具有统计学意义（ｔ＝３４２７,Ｐ＝０．００１;ｔ＝２．９１４,Ｐ＝０．００３）。结论　合并白内障的原发性急性闭角型青光眼患者行超声乳化手术,术后前房深度明显增加,房角结构得到改善,眼压得到有效控制。ＵＢＭ和ＶｉｓａｎｔｅＯＣＴ均可以客观测量原发性急性闭角型青光眼合并白内障患者的眼前节解剖参数,但临床应用价值不尽相同。     

人羊膜上皮细胞培养液抑制角膜炎症的实验研究

目的探讨人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cell,HAEC）培养液对角膜炎症反应的抑制作用及机制。方法体外培养及鉴定HAEC和兔角膜上皮细胞,制备HAEC培养液。根据培养兔角膜上皮细胞的培养液成分不同分为无血清改良杜氏培养基（Dulbecco’s modified Eagle’smedium,DMEM）组（DMEM组）、无血清DMEM与HAEC培养液1：1混合组（混合组）、HAEC培养液组（HAEC组）。传代的角膜上皮细胞贴壁24h后,用磷酸盐缓冲液润洗后按分组更换为上述3种培养液培养48h后收集细胞。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HAEC培养液中自介素-1受体拮抗剂（interleukin-lreceptor antagonist,IL-1Ra）的含量。采用实时定量聚合酶链反应（PCR）检测3组培养液中兔角膜上皮细胞中的白介素（IL）-1B信使核糖核酸（messenger RNA,mRNA）的表达,采用八肽胆囊收缩素（choleeystokinin—octapeptide,CCK-8）法检测3组细胞的增殖情况。结果HAEC和兔角膜上皮细胞的形态学观察符合上皮细胞特征。HAEC培养液中IL-1Ra的含量为（153．56±0．36）ng／L,无血清DMEM对照中未检出IL-1Ra。3组培养液中,兔角膜上皮细胞的IL-18mRNA表达由低至高分别为HAEC组、混合组和DMEM组,3组的IL-1BmRNA表达差异均有统计学意义（均为P〈0．05）。兔角膜上皮细胞分组培养24、48、72h后,HAEC组的兔角膜上皮细胞吸光值明显高于混合组和DMEM组,DMEM组的兔角膜上皮细胞吸光值在各时间点均低于混合组（均为P〈0．05）。结论HAEC可分泌IL-1Ra抑制角膜上皮细胞IL-1B的表达,减少炎症反应及移植排斥作用,并促进角膜上皮细胞增殖。