乳腺癌细胞过表达iASPP对顺铂作用的影响

目的构建过表达iASPP的乳腺癌细胞株，分析过表达iASPP对顺铂（cis-dichlorodiamine platinum，DDP）作用下乳腺癌细胞的影响。方法采用RT-PCR方法在乳腺组织中扩增出iASPP，转染人MCF-7，G418筛选获得过表达iASPP的乳腺癌细胞株，MTT和流式细胞仪分析过表达iASPP的乳腺癌细胞株在DDP作用下增殖和凋亡情况。结果成功构建了过表达iASPP的乳腺癌细胞株，过表达iASPP可明显降低DDP对乳腺癌细胞增殖的抑制作用（P〈0．01），并降低细胞凋亡的百分数（P〈0．01）。结论过表达iASPP可以明显降低乳腺癌细胞MCF-7对DDP作用的敏感性。     

基于量子点及免疫磁珠技术快速检测弓形虫抗体的实验研究

目的 应用量子点及免疫磁珠技术,建立一种简便、快速的弓形虫IgG抗体检测方法.方法 采用碳二亚胺交联法,将弓形虫抗原包被住磁性微球表面作为固相载体,量子点标记二抗作为检测抗体.检测待检血清中的弓形虫特异性抗体,并对检测条件进行优化.结果 量子点与二抗的最佳偶联条件:pH6.0、反应时间为2 h、二抗浓度为20 μg/mL.确立检测的最佳反应条件:抗原包被浓度50μg/mL,量子点标记二抗工作浓度为1:200.用本方法检测弓形虫抗体阳件血清的最大稀释度为1:1 000,而EHSA为1:500.结论 成功建立了弓形虫IgG抗体快速检测方法,该方法具有较好的特异性和灵敏度,且操作简便快速.     

陆军下士水痘并发左下肺炎1例

正1临床资料患者男,24岁,下士。因"发热8天,全身起水疱伴瘙痒6天"就诊。患者8天前训练后自觉畏寒发热,测体温39.1℃,口服"罗红霉素、速效伤风胶囊"等药物,体温渐降至正常,但不久又升高,体温波动在(37.2～37.5)℃,且2天后头、面、躯干及四肢出现少许丘疱疹或水疱,自觉瘙痒,在卫生队静滴"青霉素、病毒唑"等药物,病情好转不明显,且皮疹渐增多,并伴胸痛、咳嗽、全身乏力等症。患者既往体健,无吸烟、饮酒嗜好,无遗传病及传染病记载。入院     

Toll样受体2的研究进展

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是近年来新发现的一种同源于果蝇Toll的蛋白分子,属于Ⅰ型跨膜蛋白受体,自从研究者首先发现人类Toll样受体,目前其家族成员至少有11个[1]。TLR能够对病原体识别、结合、引发一系列信号间的转导,促进各种炎性介质的释放,在早期启动固有免疫     

人Toll样受体2胞外区基因重组腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含有人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的重组腺病毒载体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增TLR2胞外区全长基因,克隆人pMD18-T载体并经测序验证后,通过KpnⅠ和HindⅢ双酶切将目的 片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中.将构建止确的重组质粒pAdTrack-CMV-TLR2用Pme Ⅰ酶切线性化后转化感受态AdEasier-1细菌,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒.将鉴定正确的重组质粒pAd-TLR2经PacⅠ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞中进行包装并扩增病毒.观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并测定病毒滴度,用PCR法鉴定重组腺病毒.结果 RT-PCR扩增得到的目的 基因片段与GenBank中的序列一致,经酶切鉴定及PCR检测证实携带人TLR2胞外区全长基因的重组腺病毒制备成功,获得高滴度(3×109pfu/ml)的重组腺病毒.结论 成功制备了表达人TLR2胞外区基因的重组腺病毒,为后续研究奠定了基础.     

重组腺病毒介导的sTLR2和sTLR4体外抗炎效应的实验研究

目的观察重组腺病毒介导的sTLR2和sTLR4对炎症模型细胞因子表达水平的影响。方法将人单核细胞系THP-1细胞随机分为正常对照组、炎症对照组、重组腺病毒AdTLR2组、重组腺病毒AdTLR4组、重组腺病毒AdTLR2+AdTLR4组。AdTLR2和AdTLR4单独或者联合作用于各组细胞,通过RT-PCR方法检测TLR2和TLR4 mRNA表达,应用ELISA法对上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量进行检测,探讨AdTLR2和AdTLR4对LPS诱导的THP-1细胞上清细胞因子表达水平的影响。结果通过RT-PCR方法检测THP-1细胞转染AdTLR2+AdTLR4后,TLR2和TLR4能够获得高表达。AdTLR2和AdTLR4单独和联合作用于LPS所致炎症细胞后,细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量较炎症对照组显著降低,且联合作用较单独作用组进一步降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论重组腺病毒AdTLR2和AdTLR4能够降低LPS所致炎性细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量,并且联合使用的抗炎效果优于AdTLR2或AdTLR4的单独作用。提示制备的重组腺病毒能够分泌sTLR2和sTLR4,能有效抑制炎性细胞的活化,减少细胞因子的释放,具有一定的抗炎作用。     

人TLR2和TLR4胞外区cDNA的克隆

目的 从脂多糖诱导的外周血单个核细胞克隆人Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)胞外区cDNA.方法 用不同浓度脂多糖在不同时间刺激单个核细胞后提取总RNA,RT-PCR方法半定量测定TLR2和TLR4的表达,应用pUCm-T载体克隆胞外区cDNA,双酶切以及DNA测序进行鉴定.结果 单个核细胞在四种浓度脂多糖刺激3 h,6 h和12 h后.TLR2和TLR4表达并不相同.15 μg/mL脂多糖作用6 h TLR2表达最高,10 μg/mL脂多糖作用3 hTLR4表达最高.经RT-PCR扩增TLR2和TLR4胞外区cDNA分别为1 700 bp和1 900 bp,T载体克隆、酶切鉴定及测序分析后证实,目的 片段与GenBank中序列一致.结论 脂多糖的诱导对外周血单个核细胞TLR2和TLR4表达有显著影响,并且成功克隆了胞外区cDNA.     

1人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体.方法 以pUCm-TLR4质粒为模板,运用PCR技术扩增TLR4胞外区目的 基因片段,片段回收后经酶切连接穿梭质粒pAdTrack-CMV上,获得重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-TLR4.通过Kpn Ⅰ和HindⅢ双酶切,测序鉴定后,将鉴定正确的质粒经PmeⅠ酶切线性化后,转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态细菌BJ5183中,进行同源重组,卡那抗性筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR技术,Western blot等方法鉴定重组腺病毒,并进行病毒滴度测定.结果 人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体构建正确,病毒滴度为3.2×109pfu/mL.结论 成功构建了人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体,为下一步实验奠定基础.     

人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备

目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.方法: 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因, 将其克隆到表达载体pET-32a( )上构建重组原核表达质粒, 并在大肠杆菌中诱导表达, 目的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化, 用SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定.用纯化的蛋白免疫新西兰白兔, 制备多克隆抗体, 采用Western blot对抗体进行鉴定, 并用ELISA分析抗体活性.结果: 成功构建了pET-32a( )-TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达, 获得了纯化重组蛋白, 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生, 并具有良好的免疫活性.结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白, 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础.     

人Toll样受体2细胞外区基因重组腺病毒穿梭载体的构建及鉴定

目的:克隆人Toll样受体2(TLR2)细胞外区基因,并构建含有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-TLR2. 方法:应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2细胞外区基因,克隆入pUCm-T载体并转化大肠埃希菌感受态DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序分析后,用KpnⅠ和HindⅢ双酶切,将目的片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,双酶切鉴定并测序验证. 结果:RT-PCR扩增得到约1 000bp的目的基因片段,TA克隆后测序鉴定与GenBank中的序列一致,经酶切连接成功地将目的基因插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中. 结论:成功克隆了人TLR2细胞外区基因,并构建了含目的基因的重组腺病毒穿梭载体.