人源性促甲状腺激素受体单链抗体Fc 融合蛋白的制备及鉴定

目的:构建含有促甲状腺激素受体抗体(TRAb)单链抗体的重组载体pFastBac~(TM)1-ScFv-IgG1Fc,通过Bac-to-Bac表达系统实现单链抗体融合蛋白的高效表达,并检测目的蛋白表达和免疫学活性。方法:TRAb抗体的重链可变区(HV)和轻链可变区(LV)的序列以linker(G4S)连接,构建ScFv;Genbank检索人IgG1Fc序列,SnapGene软件分析上述序列和载体pFastBac~(TM)1,以基因合成方式构建重组质粒pFastBac~(TM)1-ScFv-IgG1Fc;pFastBac~(TM)1-ScFv-IgG1Fc转化感受态大肠杆菌DH10Bac生成重组杆粒,pUC/M13正向和反向引物进行PCR分析确认目的基因的序列;重组杆粒采用Cellfectin?Ⅱ试剂转染昆虫细胞Sf9生成P1病毒储液,继续感染Sf9生成高滴度的P2和P3病毒储液;P3病毒储液感染High Five~(TM)细胞,收集上清通过SPA-Sepharose CL-4B亲和层析纯化获得较纯的单链抗体融合蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白;化学发光和免疫组化检测目的蛋白抗原结合力。结果:PCR扩增得到约3 747 bp的基因序列,重组杆粒中目的基因正确插入;目的蛋白位于55 kDa附近且无杂带,纯度较高;目的蛋白浓度为248 U/L,单链抗体融合蛋白的结合力较好。结论:Bac-to-Bac表达系统成功构建并表达了TRAb单链抗体融合蛋白,抗原亲和力良好。     

合肥市适龄儿童麻疹疫苗强化免疫效果评价

目的了解合肥市适龄儿童麻疹疫苗(MV)强化免疫活动(SIA)效果及影响因素,为调整和实施消除麻疹策略提供参考。方法应用分层随机抽样法,选择合肥市社区疫苗接种门诊、幼儿园、小学、中学等作为研究点,分析8月龄～14岁儿童SIA前后麻疹抗体水平。SIA前后分别调查儿童340名和348名,应用描述统计方法,分析SIA前后麻疹流行状况。结果合肥市适龄儿童MV总体接种率为98.04%。SIA后麻疹抗体阳性率、几何平均滴度(GMT)均上升,麻疹抗体阳性率为91.38%。1～4岁组、≥3次免疫史者GMT分别为最高,Logistic多元回归分析显示,1次免疫史者抗体保护水平低。2010年麻疹发病率为0.81/10万,较2009年下降91.86%,发病年龄以婴儿为主,≥2次免疫史者病例构成比最低。结论在麻疹逐渐减弱流行阶段,需要规范适龄儿童首剂次、2剂次MV常规免疫,开展必要强化免疫,加强免疫规划和病例监测质量管理。     

高迁移率族蛋白1对奥沙利铂诱导的SGC-7901胃癌细胞凋亡的影响

目的 构建pDsRED2-HMGB1重组质粒,探讨转染高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对奥沙利铂诱导的SGC-7901细胞凋亡的影响.方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HMGB1 mRNA全编码序列,将PCR产物插入到pDsRED2-N1载体的Xho I和EcoR I位点,构建pDsRED2-HMGB1重组质粒;通过脂质体法转染SGC-7901胃癌细胞,荧光显微镜检测HMGB1红色荧光融合蛋白表达.Western blot鉴定HMGB1蛋白表达.应用流式细胞仪(Annexin-V/PI标记)分析HMGB1过表达对奥沙利铂诱导胃癌细胞凋亡的影响.结果 成功构建真核表达质粒pDsRED2-HMGB1,转染SGC-7901细胞后,荧光显微镜下可见细胞内有HMGB1红色荧光融合蛋白的表达;流式细胞术检测发现转染pDsRED2-HMGB1后SGC-7901细胞凋亡水平较转染pDsRED2-N1组下降22.4%.结论 HMGB1过表达可抑制奥沙利铂诱导的SGC-7901胃癌细胞凋亡.     

可溶性小鼠BTLA对树突状细胞表面B7-1和B7-2表达的影响

目的研究可溶性小鼠B/T淋巴细胞弱化因子（murine B and T lymphocyte attenuator ，mBTLA）-人IgG1 Fc融合蛋白（mBTLA-hIg）对树突状细胞表面共刺激分子表达的影响。方法克隆mBT／A基因，构建mBTLA胞外功能区和人IgG1Fc融合基因的真核表达载体（pmBTLA-hIg），并采用脂质体转染法，将pmBTLA-hIg质粒转染小鼠树突状细胞系（DC2．4）。采用RT-PCR、ELISA和Westem blot分别检测pmBTLA-hIg质粒转染DC中mBTLA基因mBNA的表达及细胞培养上清中mBTLA-hIg融合蛋白的表达；采用流式细胞术检测pmBTLA-hIg质粒转染对DC2．4表面共刺激分子B7-1（CD80）和B7-2（CD86）表达的影响。结果成功克隆了小鼠BT／A基因，并构建了真核表达载体；mBTLA-hIg融合基因转染的DC高表达mBTLA-hIg融合蛋白，并可结合到DC表面。表达可溶性mBTLA-hIg融合蛋白的DC2．4表面B7．1的表达上调，B7-2的表达下调，而且这种改变可被兔抗GST-mBTLA血清阻断。结论可溶性mBTLA-hIg融合蛋白对DC细胞表面研分子的表达具有调节作用，可能是BTLA反向信号作用于DC的结果。     

脂多糖诱导巨噬细胞自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体的形成

目的构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒并转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,观察脂多糖(LPS)诱导其自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体形成的过程。方法根据编码小鼠微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的开放读码框(ORF)设计引物,RT-PCR扩增小鼠LC3B的ORF,构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒;脂质体法转染并筛选稳定表达RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察及Western blot鉴定LC3B-GFP融合蛋白表达;LPS刺激稳定转染的RAW264.7细胞株,激光共聚焦显微镜检测不同时间绿色荧光聚集体的分布。结果成功构建真核表达质粒pEGFP-C1/LC3B,并获得稳定表达LC3B-GFP融合蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白分布,Western blot鉴定表达LC3B-GFP融合蛋白,激光共聚焦结果显示LPS刺激前融合蛋白呈弥散性分布在胞浆中,而LPS刺激后细胞内有明显绿色荧光聚集体形成并呈时间依赖性逐渐增加。结论成功构建pEGFP-C1/LC3B,转染RAW264.7细胞可正确表达LC3B-GFP融合蛋白,LPS刺激后显示绿色荧光聚集体形成。     

IL-4与IL-10调控CD4+ T细胞CXC趋化性细胞因子受体4的研究

目的研究IL-4和IL-10对CD4+ T细胞上CXC趋化性细胞因子受体4（CXCR4）表达的调控。方法采用流式细胞术,实时定量逆转录PCR（RT-PCR）,细胞因子的趋化性分析以及Scatchard分析法检测CXCR4和CXCR4 mRNA。结果 IL-4和IL-10能够显著上调或下调CD4+ T细胞上CXCR4的表达。SDF-1诱导的CD4+ T细胞趋化性同样也受到IL-4和IL-10的调控。IL-4和IL-10能分别上调或下调CD4+ T细胞中CXCR4的mRNA表达。在新鲜分离的CD4+ T细胞上只存在一种亲和力的CXCR4（Kd 6.3 nmol*L-1）。而IL-4刺激的CD4+ T细胞存在两种不同亲和力的CXCR4（Kd1 4.4 nmol*L-1和Kd2 14.6 nmol*L-1）。IL-4和IL-10通过环腺苷酸和环鸟苷酸双重信号途径对CD4+ T细胞上CXCR4表达的调控与Ca2+激活刺激无关。IL-4和IL-10可能是通过CD26来调控CXCR4在CD4+ T细胞上的表达。结论 IL-4和IL-10对CXCR4-SDF-1受体-配体对的调节,在HIV侵袭和炎症感染进程有关的细胞因子环境中起着重要作用。     

辛伐他汀抑制oxLDL诱导的巨噬细胞焦亡

目的 探讨辛伐他汀在氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导巨噬细胞焦亡中的作用及机制.方法 oxLDL作用于J774A.1小鼠巨噬细胞,采用乳酸脱氢酶(LDH)释放试剂盒检测LDH的释放,荧光显微镜观察吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB)的染色情况来判断焦亡细胞膜的完整性;Western blot检测LC3-Ⅱ/Ⅰ、caspase-1与白介素-1β(IL-1β)的蛋白表达情况;分别加入辛伐他汀、3-甲基腺嘌呤(3-MA)自噬阻断剂等药物后,检测上述实验结果的变化情况.结果 在oxLDL诱导的巨噬细胞脂质聚集的过程中,辛伐他汀药物有保护膜完整性的作用,并且显著减少LDH的释放,AO/EB荧光染色结果可观察到橘红色荧光(EB)所占比例显著降低,并抑制caspase-1的激活和IL-1β的分泌.然而,当巨噬细胞的自噬过程被3-MA所阻断时,Westem blot结果显示LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达下调,caspase-1的活性和成熟的IL-1β分泌增加;同时LDH实验和染色实验结果也显示,LDH释放增多、AO/EB染色中橘红色荧光增加,表明oxLDL诱导的巨噬细胞膜的损伤进一步加重.结论 辛伐他汀可抑制oxLDL诱导的巨噬细胞焦亡,可能与增强oxLDL诱导的巨噬细胞自噬有关.     

脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞parkin表达及线粒体自噬形成

目的:探讨巨噬细胞在脂多糖(LPS)处理后parkin表达及对线粒体自噬的影响。方法:无菌分离并原代培养小鼠腹腔巨噬细胞;200 ng/ml LPS作用巨噬细胞,JC-1标记线粒体,流式细胞仪检测线粒体膜电位变化;RT-PCR检测巨噬细胞parkin mRNA水平;Western blot检测parkin及自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平;激光共聚焦显微镜分别检测巨噬细胞在LPS处理前后parkin在细胞内的分布及与LC3和线粒体三者的共定位情况。结果:JC-1染色流式细胞仪检测结果显示,LPS处理后,巨噬细胞线粒体膜电位降低,并随LPS作用时间延长呈持续下降趋势;parkin mRNA在LPS处理6 h内仅有少量的增加,但parkin蛋白水平在LPS刺激6 h后增加明显;parkin在巨噬细胞定位结果表明,未受LPS处理时parkin呈弥散均匀分布,而LPS刺激后parkin呈明显的点状聚集;Western blot检测结果显示巨噬细胞在LPS刺激后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增大,表明巨噬细胞发生明显的自噬;激光共聚焦显微镜结果显示,巨噬细胞在LPS刺激后,parkin、LC3和线粒体三者存在共定位关系。结论:巨噬细胞在LPS刺激后,parkin表达增加并介导线粒体自噬形成,参与对损伤线粒体的清除,可能在巨噬细胞参与的炎症反应中发挥一定的调控作用。     

供心体外转染腺病毒介导的CD40Ig融合基因延长小鼠移植心脏存活时间

目的探讨体外转染CD40Ig融合基因对小鼠移植心脏存活时间的影响。方法构建携带小鼠CD40胞外段和人IgGFc融合基因的重组腺病毒载体(AdCD40Ig),以BALB/c小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者,建立小鼠腹部异位心脏移植模型,实验组供心移植前在体外以AdCD40Ig灌注,转染CD40Ig基因,另设空载体转染对照组、非转染对照组和近交系对照组(供、受者均为近交系C57BL/6小鼠)。术后观察移植心的存活及移植物中炎症细胞浸润情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测受者体内CD40Ig融合蛋白表达情况,流式细胞仪检测受者体内产生γ干扰素(IFN-γ)的脾细胞。结果实验组移植心的存活时间达(15.8±0.7)d,明显长于空载体转染对照组和非转染对照组(P<0.01)。术后第2d,实验组受者体内CD40Ig融合蛋白表达最高,1周后明显降低。术后第7d,实验组移植心组织中浸润的炎症细胞明显比未处理对照组和空载体对照组少。实验组产生IFN-γ的CD4+和CD8+T淋巴细胞分别为(2.18±0.16)%和(10.82±0.74)%,与近交系对照组接近,明显低于未处理对照组和空载体对照组(P<0.01)。结论供心体外转染CD40Ig融合基因可有效抑制移植后受者体内同种T淋巴细胞的增殖,并延长移植心的存活时间。     

晚期糖化终产物受体在小鼠急性肝损伤中的表达及意义

目的探讨晚期糖化终产物受体(RAGE)在刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠急性肝损伤中的表达及意义。方法将72只昆明种小鼠随机分为对照(NS)组、ConA组,分别于注射后2、6、12、18、24、48 h眼球取血并留取肝脏标本,用赖氏法检测血清中谷氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)活力;HE染色法检查肝组织病理学改变;RT-PCR技术检测肝组织高迁移率族蛋白1(HMGB1)、RAGE、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-lβ)mRNA的表达;免疫组化法检测肝组织HMGB1蛋白的表达;Westernblot法检测肝组织RAGE蛋白的表达;ELISA法检测血清中TNF-α、IL-lβ含量。结果成功构建ConA诱导小鼠肝损伤模型;注射ConA 2 h肝组织中HMGB1 mRNA表达即增加,至18 h达峰值(P<0.01);HMGB1蛋白表达明显聚集于坏死区域;肝组织RAGE mRNA于12 h表达上调;RAGE蛋白的表达于24 h达到峰值,与NS组相比差异有统计学意义(P<0.01);肝组织TNF-αmRNA表达分别在6、24 h出现2个峰值,血清TNF-α含量在注射ConA 2 h达峰值(455.25 ng/L),随后逐渐减低,至48 h与NS组相比无明显差异;注射ConA各时间点小鼠肝组织与血清中IL-1β水平均显著高于NS组(P<0.01)。结论在ConA诱导小鼠急性肝损伤模型中,损伤肝组织RAGE的表达显著增加,这可能与诱导肝组织损伤中炎症因子的进一步产生有关。