移植用小鼠胶质前体细胞的培养及其移植后形态和功能初探

目的 完善体外分离培养移植用胶质前体细胞的方法,并运用双光子显微镜在活体动物水平,对小鼠大脑皮层移植的胶质细胞进行单细胞水平的在体功能研究.方法 体外分离培养小鼠胚胎神经干细胞,并将其诱导为胶质前体细胞及星形胶质细胞.分别用Nestin、A2B5以及GFAP对体外培养的神经干细胞、胶质前体细胞以及星形胶质细胞进行形态学鉴定.体外给予ATP及毒胡萝卜素(Thapsigargin),对体外分化的星形胶质细胞进行功能学鉴定.将以上诱导得到的胶质前体细胞移植入成年小鼠大脑皮层,并在移植12周后对其进行形态学观察.另外,应用双光子活体钙成像技术,观察移植胶质细胞对ATP刺激的反应.结果 ①体外诱导神经干细胞成为胶质前体细胞(A2B5阳性)的比率达到(87.4±3.4)％,继续将其诱导为成熟星形胶质细胞(GFAP阳性)的比率达到(83.4±3.3)％.②体外诱导而来的星形胶质细胞可对ATP及毒胡萝卜素产生钙反应.③移植进入成年小鼠皮层的胶质前体细胞,在移植12周后仍可存活,并可分化为成熟的星形胶质细胞.④双光子活体钙成像实验证实,ATP可诱导活体小鼠皮层内移植细胞产生钙信号.结论 神经干细胞来源的胶质前体细胞在移植进入成年小鼠皮层内可分化为成熟星形胶质细胞,并至少存活12周.另外,胶质前体细胞在移植4周后,便可在活体动物大脑皮层内具备功能活动.     

1800 MHz射频电磁场通过瞬时受体电位C通道影响原代大鼠皮层神经元突起生长

目的 研究1 800 MHz射频电磁场(radio frequency electromagnetic field,RF-EMF)对原代培养皮层神经元突起生长的影响,并通过瞬时受体电位C通道介导的钙内流,探讨RF-EMF对突起生长影响的机制.方法 将原代培养皮层神经元(primarily cultured cortical neurons,PCCNs)用随机数表法分为4组:假暴露(Sham)、Sham+SKF-96365、辐照组(RF)和RF+SKF-96365组.使用sXc-1800辐照系统,1 800 MHz频率talk模式,5 min开10 min关,比吸收率为4 W/kg,辐照组辐照时间分别为12、24 h和48 h.SKF-96365干预处理是在维持培养基中加入SKF-96365(5μmol/L)后与假暴露组、RF组进行相同的处理.辐照结束后即刻进行以下指标检测:①细胞活力(CCK-8法)和LDH释放;②TRPC1、TRPC3蛋白表达(Western blot);③钙库操纵性钙内流变化(store-operated calcium entry,SOCE)(激光共聚焦显微镜);④神经元突起总长度、初级突起数和分支数(Tuj-1免疫荧光染色).结果 RF组细胞活力和LDH释放与相应Sham组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).与Sham组比较,RF组辐照24 h后,TRPC1和TRPC3蛋白表达分别降低24％和23％,SOCE下降54％,辐照48 h引起PCCNs突起总长度、初级突起数和分支数分别下降20％、12％、31％,以上变化均有统计学意义(P＜0.05).Sham+SKF-96365组SOCE下降24％,突起总长度、初级突起数、分支数分别下降10％、12％、24％,与Sham组比较均有统计学意义(P＜0.05),而RF+ SKF-96365组SOCE和突起总长度、突起数、分支数的变化与RF组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RF-EMF可引起原代皮层神经元突起长度、初级突起数和分支数减少,该效应可能与TRPC1和TRPC3通道蛋白表达降低和TRPC通道介导的钙信号减弱有关.