过表达 C3aR人足细胞的构建及鉴定

目的：构建过表达C3a受体（C3aR）的肾小球足细胞株,为探讨C3aR在肾小球足细胞中的确切生理和病理意义提供细胞模型。方法设计合成人C3aR 表达单元,将其克隆到慢病毒表达载体pLenti6．3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3aR表达载体pLenti6．3-C3aR-IRES2-EGFP;将pLenti6．3-C3aR-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞,包装成C3aR表达重组慢病毒LV-C3aR;以LV-C3aR感染人肾小球足细胞系HPC,根据LV-C3aR上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点,以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆;利用荧光定量PCR和细胞免疫化学分析方法对稳定转染细胞克隆的C3aR表达水平进行分析,从中鉴定出稳定过表达C3aR的人肾小球足细胞株。结果成功构建了C3aR表达载体pLenti6．3-C3aR-IRES2-EGFP;得到了高滴度的C3aR表达重组慢病毒LV-C3aR;成功构建了过表达C3aR的人肾小球足细胞株HPC-C3aR。结论成功构建C3 aR表达载体和过表达C3 aR的人肾小球足细胞株,为进一步研究C3 aR过表达在人肾小球足细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3 aR在其他细胞中的生理、病理意义创造了条件。     

肥大细胞在糖尿病肾病患者肾组织中的分布及相关性研究

目的 糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是慢性炎症性疾病.肥大细胞是多功能的免疫细胞,具有以多种方式参与DN发生发展的潜在能力.但目前尚未见有较全面的对肥大细胞与DN关系的分析和研究报道.文中研究在DN发生发展过程中肾组织中肥大细胞数量、活化水平的变化,及探讨肥大细胞与DN发生发展的相关性及可能病理作用.方法 选取DN病例80例,其中早期19例、中期32例,晚期29例.同时选取正常供肾16例作为正常对照.以类胰蛋白酶作为肥大细胞标记分子,利用免疫组化的方法分析肾穿刺组织标本中肥大细胞的数量.以CD3、CD20、CD68分别作为肾组织T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞的标记分子,利用免疫组化染色方法分析肾穿刺组织标本中上述炎症细胞数量.根据肥大细胞周围的甲苯胺蓝异染颗粒及细胞内颗粒减少情况分析肥大细胞的脱颗粒反应,据以分析肾织织肥大细胞的活化水平.以此为基础分析肾组织中肥大细胞与DN临床病理指标的相关性.结果 ①在正常对照和DN患者的肾组织中肥大细胞主要分布于肾小管间质,肾小球中极少发现肥大细胞.DN患者的肾组织中,还可见肥大细胞侵入肾小管壁.②正常对照肾组织肥大细胞数量很少.在DN的肾组织中,肥大细胞数量随着病情发展而显著增加.③与正常对照相比,DN患者肾组织肥大细胞发生脱颗粒的比例显著增高,且表现为随DN进展而逐渐增加的趋势.④相关性分析显示,DN患者肾组织肥大细胞数量与肾功能损伤指标、小管间质损伤指标和炎症指标具有显著相关性.结论 肥大细胞参与DN的发生发展过程,可能主要通过脱颗粒作用,释放细胞内的生物活性物质.肥大细胞在DN的肾小管间质损伤中发挥重要作用.肥大细胞可望成为DN防治的新靶标.     

糖尿病肾病小鼠新相关基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建小鼠“REKEN cDNA 0610006H10”基因表达载体pPRO-6AB，了解此表达载体在大肠杆菌中表达的情况。方法：从克隆有“REKEN cDNA 0610006H10”基因cDNA的载体pUCm-6AB中切取长约1．1kb的“REKENcDNA 0610006H10”基因cDNA，将它克隆到原核表达载体pPROTet-E的多克隆位点中。以限制性内切酶酶切分析的方法对重组克隆进行初步鉴定，以测序法对重组子进行验证。在确证得到了预期的表达载体pPRO-6AB后，以氯化钙转染法将表达载体导人大肠杆菌BL21PRO中作蛋白表达分析。蛋白分析方法采用SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用胶浓度为10％，交联度为3．3％。电泳结束后利用考马丝亮蓝染色法进行染色。结果：得到了预期的“REKEN cDNA 0610006H10”基因原核表达载体pPRO-6AB“REKEN cDNA 0610006H10”基因成功地在大肠杆菌中实现了表达。结论：我们成功地构建了小鼠“REKEN cDNA 0610006H10”基因表达载体pPRO-6AB，在大肠杆菌中成功地进行了“REKEN cDNA 0610006H10”基因的表达，从而为进一步研究“REKEN cDNA 0610006H10”基因编码蛋白的结构和功能，探讨“REKEN cDNA 0610006H10”基因在糖尿病肾病发生、发展过程中的可能作用创造了条件。     

条件性基因打靶及其研究进展

条件性基因打靶是在常规的基因打靶 (基于同源重组原理的基因打靶 )的基础上 ,结合重组酶介导的位点特异性重组技术而发展起来的一种基因打靶新方法。与常规的基因打靶方法相比 ,它对生物基因组的修饰具有时空可控性 ,显示出广阔的应用前景。本文主要就条件性基因打靶的原理、方法、特点及应用前景作一综述     

基因组修饰研究的策略

人类基因组计划的完成使人类对自身奥秘的探索进入了一个全新的阶段。但人类基因组计划本身并没有说明太多的问题 ,大量的人类基因组“诠释”工作 (基因功能研究 )才是意义之所在。研究基因功能的方法有多种 ,而最为直接 ,也是最为可靠的则是对基因组的直接修饰 :即转基因和基因敲除。由于具有饲养方便、繁殖迅速、与人类基因组的相似性高等特点 ,小鼠已成为研究哺乳动物基因功能的理想模型动物。与此相对应 ,近年来已发展了一系列关于构建转基因小鼠和基因敲除小鼠的策略和方法。利用这些方法产生了数以千计的转基因小鼠和基因敲除小鼠 ,为…     

db/db糖尿病肾病小鼠肾脏基因表达谱及大黄酸对其的影响

目的 :利用基因芯片技术了解db/db糖尿病小鼠肾脏基因表达谱及其经大黄酸治疗后的变化 ,进一步研究糖尿病肾病 (DN)的分子发病机制和大黄酸治疗DN的作用机制。　 方法 :利用国际学术界公认的标准化Affymetrix公司生产的GM U74A基因芯片分别检测正常对照组 (db/m小鼠 )、DN组 (db/db小鼠 )、大黄酸治疗组 [大黄酸 15 0mg/ (kg·d)治疗 12周 ]肾脏基因表达谱 ,并利用生物信息学方法对检测结果进行分析。　 结果 :分别得到了正常对照组、DN组、以及大黄酸治疗组的肾脏基因表达谱。分析发现 ,在总共 12 437个基因 (包括EST)中 ,与正常对照组相比 ,DN组有 10 85个基因表达下调 ,37个基因表达上调 ,其中变化幅度大于 2倍的分别有 16 6个和 2 9个 ;与DN组相比 ,大黄酸治疗组有 384个基因表达下调 ,15 5个表达上调 ,其中变化幅度大于 2倍的分别有 47个和 30个。结论 :利用基因芯片技术在阐明了DN肾脏基因的表达谱同时 ,证实大黄酸治疗可以改变其基因的表达谱 ,为进一步研究DN的分子发病机制和大黄酸治疗的作用机制创造了条件。     

CXCL16在db/db糖尿病肾病小鼠肾组织中的表达

目的:了解在糖尿病肾病(DN)发生发展过程中,CXCL16在db/db小鼠肾脏中的表达变化,并对其与DN的相关性进行初步探讨. 方法:选取分别代表DN不同发展阶段的4、8、12、16和20周龄的dh/db小鼠和同龄db/m小鼠各6只;取左肾的一半用于提取总RNA;右肾用于制作冰冻切片、石蜡切片、电镜标本等;利用半定量RT-PCR的方法分析各组小鼠肾脏中CXCL16 mRNA相对表达水平,以免疫组化的方法分析CXCL16蛋白在各组小鼠肾组织中的表达和分布情况;同时测定各组小鼠的体重、血糖、血三酰甘油、血胆固醇和24h尿白蛋白排泄量,分析各组小鼠的肾脏组织病理情况以了解小鼠DN的发生发展情况. 结果:(1)与同龄的db/m小鼠相比,4周龄的db/db小鼠的体重有所增加,但血糖、血三酰甘油、血胆固醇、24h尿白蛋白排泄量均无明显差异,肾脏组织病理分析也无明显变化,说明4周龄的db/db小鼠尚未发生糖尿病;但8周龄的db/db小鼠的血糖、24h尿白蛋白排泄量均已有明显升高,且肾组织中也已出现肾小球肥大、系膜区扩张、基膜增厚等DN病理改变,说明8周龄的db/db小鼠已发生了DN,但从各方面的情况来看,8周龄db/db小鼠的DN仍较轻,可代表DN早期的情况;自8周龄以后,db/db小鼠的血糖、血三酰甘油、血胆固醇、尿白蛋白排泄量以及肾小球肥大、系膜区扩张、基膜增厚等情况随着鼠龄的增长而不断的增加,说明db/db小鼠的DN不断进展.(2)与同龄的db/m小鼠相比,CXCL16在4周龄的db/db小鼠肾脏中的表达并没有明显变化;但8周龄db/db小鼠肾脏中CXCL16的表达水平已有所增加.此后,随着鼠龄的增加,DN的进展,CXCL16的表达水平逐渐增加.(3)在成年正常小鼠,CXCL16主要分布于小鼠肾脏髓质的小管中,相对来说在肾脏皮质中的分布较少;在DN小鼠,分布在肾小管和小球中的CXCL16均有明显增加;且肾小球CXCL16的表达增加主要发生在足细胞的位置.(4)CXCL16在幼年小鼠(指4周龄的db/m和db/db小鼠)肾脏中的表达分布与成年小鼠(指8周龄以上)亦存在一些差异,这可能提示CXCL16与小鼠肾脏的正常生长发育有关. 结论:db/db小鼠肾脏中CXCL16的表达随DN的发生发展而增高,至少在时间上与DN具有相关性,提示CXCL16可能参与DN的病理过程.     

基于Cre重组酶体系的小鼠HPRT定点整合打靶载体的构建及其应用

目的：构建带有Cre重组酶识别位点变异体lox66的针对小鼠HPRT基因的基因打靶载体,并用于小鼠胚胎干细胞基因打靶研究。方法：利用含HPRT基因组DNA片段的质粒pMP8和人工合成含lox66序列的寡核苷酸,构建含Cre重组酶识别位点变异体lox66的置换型打靶载体,经过限制性内切酶酶切鉴定其结构正确后,用电穿孔法对小鼠胚胎干细胞R1株进行基因转染,经G418／6－TG（6－thioguanine)分组药物筛选,进行pSP-HPRT-lox66-Neo载体的应用研究。结果：得到了与设计一臻的置换型打靶载体pSP-HPRT-lox66-Neo;将线性化的打靶载体导入ES细胞后,能与靶位点有效地发生同源重组,获得了20个靶基因被灭活了的ES细胞克隆。结论：此研究成功构建了含Cre重组酶识别位点变异位lox66针对小鼠HPRT基因位点的置换型打靶载体,在胚胎干细胞基因打勒中得到有效的应用。     

线粒体与细胞功能调节

长期以来,人们对线粒体功能的关注,主要集中于线粒体在细胞代谢方面的作用。作为细胞的一个主要代谢场所,线粒体在细胞中的重要性是显而易见的:糖酵解产生的丙酮酸在这里彻底分解成二氧化碳和水;长链脂肪酸在这里进行β氧化,产生的乙酰辅酶A也在这里最后彻底分解;此外,脂肪酸、     

条件性基因打靶及其研究进展

条件性基因打靶是在常规的基因打靶（基于同源重组原理的基因打靶）的基础上,结合重组酶介导的位点特异性重组技术而发展起来的一种基因打靶新方法。与常规的基因打靶方法相比,它对生物基因组的修饰具有时空可控性,显示出广阔的应用前景。本主要就条件性基因打靶的原理、方法、特点及应用前景作一综述。