不同培养方法对体外诱导分化Th17细胞的影响

目的:Th17细胞缺乏特异性表面标记,难以分离纯化活细胞,通过调整细胞因子浓度和不同培养方法,以获得高纯度Th17细胞亚群?方法:选用C57BL/6J 小鼠脾脏获得单个核细胞,磁珠分选获得CD4+?CD44-Naive T细胞?建立不同Th17诱导培养体系,通过流式细胞术检测获得Th17细胞的比例,荧光定量PCR方法检测ROR-γt?IL-17 mRNA表达水平,ELISA方法检测细胞培养上清中IL-17浓度,以寻找最佳培养条件?结果:TGF-β+IL-6+IL-23可诱导Th17细胞,但比例较低;加入TNF-α?IL-1β?anti-IFN-γ?anti-IL-2可进一步提高Th17比例,但后期培养呈衰减趋势;使用U型96孔板培养Th17细胞明显优于24孔板培养,细胞分化呈稳定上升趋势,培养第9天Th17细胞可达(91.85 ± 1.05)%?IL-17?ROR-γt mRNA与Naive T细胞相比明显上调(P < 0.001),IFN-γ?IL-4?Foxp3 mRNA表达量低(P < 0.001),细胞培养上清液中IL-17浓度明显升高(P < 0.001)?结论:调整细胞因子诱导方案?缩小培养面积可不同程度提高Th17细胞诱导比率,且培养面积的影响作用更为显著?