Flt3l与肿瘤关系的研究进展

酪氨酸激酶受体3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3l)是新发现的一种细胞因子.该因子与fms样酪氨酸激酶受体3 (fms-like tyrosine kinase 3 receptor,Flt3R)特异性结合,可促进多种干细胞、血细胞及其前体细胞的生成与分化.     

医学微生物学实验教学对医学生创新能力培养的研究

创新教育是教学活动的核心,是高等医学院校实施素质教育的重点.实验教学在培养医学生创新意识方面有着得天独厚的优势.医学微生物学是与临床结合紧密,实践性很强的一门基础课.在医学微生物学实验教学中,我们采用了基础性验证性实验、综合性设计性实验、探索性创新性实验、开放性科研性实验四段式教学模式,探讨通过该实验教学方法培养医学生创新能力的效果.教学效果评价显示:四段式教学模式有效地激发了学生的学习兴趣、培养了学生独立思考的习惯、锻炼了学生的实践动手能力,其在培养学生创新思维、创新精神及创新能力方面亦起到了明显作用.     

柯萨奇病毒B3 VP1蛋白、rAd/VP1和pcDNA3/VP1的免疫效果比较

目的 观察柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)衣壳蛋白VP1、表达VP1蛋白的重组腺病毒rAd/VP1和重组质粒pcDNA3/VP1的免疫效果.方法 用原核细胞表达VP1蛋白并纯化、扩增重组腺病毒rAd/VP1,扩增并提取真核表达质粒pcDNA3/VP1.BALB/c小鼠随机分为4组,每组18只,分别在股四头肌注射VP1蛋白、rAd/VP1、pcDNA3/VP1和PBS.VP1蛋白组和pcDNA3/VP1组免疫3次,间隔3周;rAd/VP1组免疫2次,间隔2周.VP1蛋白、pcDNA3/VP1和rAd/VP1每次每只注射剂量分别为50μg、100μg和1.2×107PFU.用ELISA法和微量中和试验法检测各次免疫后血清CVB3特异性IgG抗体和中和抗体滴度;末次免疫后3周,CCK-8法检测脾脏淋巴细胞的CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察动物的存活情况.结果 VP1蛋白组血清特异性IgG抗体和中和抗体滴度明显高于其他实验组(P＜0.05),而脾脏淋巴细胞CTL杀伤活性低于rAd/VP1组(P＜0.05);致死量病毒攻击后,VP1蛋白组血中病毒滴度低于pcDNA3/VP1和rAd/VP1组(P＜0.05),生存率明显高于这两组(P＜0.05).结论 VP1蛋白疫苗能诱导较高水平的体液免疫应答,对动物有明显的免疫保护作用,免疫效果优于质粒pcDNA3/VP1和重组腺病毒rAd/VP1.

Abstract：

Objective To compare the immune effects of Coxsackievirus B3 (CVB3) capsid protein VP1 expressed bacterially, recombinant adenovirus rAd/VP1 and recombinant plasmid pcDNA3/VP1which express VP1 protein in mice. Methods After expressed in prokaryotic cells, VP1 protein was purified. Recombinant adenovirus rAd/VP1 and recombinant plasmid pcDNA3/VP1 were amplified and extracted. Six to 8-week-old, male BALB/c mice were divided into four groups randomly. Each group contained 18 mice. The mice of pcDNA3/VP1 group or VP1 protein group were immunized intramuscularly with three injections at three weeks apart, of recombinant plasmid pcDNA3/VP1 at a dose of 100 μg/mouse or recombinant protein VP1 at a dose of 50 μg/mouse. The mice of rAd/VP1 group were immunized intramuscularly twice at two weeks interval with rAd/VP1 at a dose of 1.2 × 107 PFU. The control group was mock-immunized with 100 μl of PBS intramuscularly. Mice were bled from the retroorbital sinus plexus every two weeks after each immunization. ELISA and micro-neutralization test were used to detect levels of CVB3-specific IgG antibody and neutralizing antibody titers in the sera of immunized mice. Three weeks after the last immunization, the cytotoxic T lymphocyte(CTL) killing activity of spleen lymphocytes was detected with CCK-8 assay. Subsequently, virus titers in the sera of immunized mice were determined by the 50% cell culture infective dose( CCID50 ) assay on HeLa cell monolayers and percentage of animals surviving were observed after lethal CVB3 attack over a period of 21 days. Results The titers of specific IgG antibody and neutralizing antibody in sera of VP1 protein immunized mice were higher than other groups( P ＜0.05 ). While CTL killing activity of spleen lymphocytes of VP1 protein immunized mice was lower than mice in rAd/VP1 group( P ＜0. 05). Virus titers in sera of VP1 protein immunized mice were lower than the mice in pcDNA3/VP1 or rAd/VP1 groups ( P ＜ 0.05 ), while survival rate was significantly higher than these two groups ( P ＜ 0.05 ).Conclusion VP1 protein induced higher level of humoral immune response and acquired obvious immune protection effects in mice. The immunizing potency of VP1 protein vaccine surpassed plasmid pcDNA3/VP1or recombinant adenovirus rAd/VP1. It appeared to be a promising candidate among the three different vaccines.     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用的免疫效果

目的 构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1,观察Ad/MDC-VP1与NA疫苗联合应用的免疫效果.方法 构建、包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1并检测目的 蛋白的表达.BALB/c小鼠随机分为Ad/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/MDC-VPl+Ad/MDC-VP1和PBS 4组,肌肉注射免疫小鼠.用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清柯萨奇病毒B3(CVB3)VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率.结果 成功构建并包装了重组腺病毒Ad/MDC-VP1,检测到目的 蛋白的表达.peDNA3/MDC-VP1+Ad/MDC-VP1组血清CVB3 VP1 IsG滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤活性和对小鼠的保护率明显高于其他各组(P<0.05),血清病毒滴度低于其他各组(P<0.05).结论 Ad/MDC-VP1与DNA疫苗联合应用能显著提高小鼠细胞和体液免疫应答.     

免疫途径和佐剂对CVB3VP1蛋白免疫效果的影响

目的:观察不同免疫途径和佐剂类型对柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus group B type 3,CVB3)衣壳蛋白VP1免疫效果的影响.方法:将原核表达质粒pET-his/VP1转入E.coli BL21 (DE3) pLysS中,用异丙基-1-硫代-β呋喃半乳糖苷(IPTG)诱导CVB3VP1蛋白的表达并进行纯化.首先采用不同的免疫途径(皮下,腹腔,肌肉)用VP1蛋白免疫小鼠,每组12只.然后另取小鼠分为PBS组和不同佐剂组(氢氧化铝、弗氏佐剂、Montanide ISA720),每组18只,采用肌肉注射途径免疫.每次每只小鼠注射50μg,共免疫3次,间隔3周.用ELISA和微量中和试验检测血清特异性IgG抗体和中和抗体.用CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性.用致死量的CVB3攻击后,检测血中病毒的滴度并观察小鼠的存活状况.结果:在大肠杆菌中成功表达CVB3VP1蛋白.三种免疫途径比较,肌肉注射组血清中和抗体和特异性IgG抗体的水平明显高于其他组(P＜0.01).采用肌肉注射免疫时,弗氏佐剂组Montanide ISA 720佐剂组的体液免疫和细胞免疫应答的水平明显高于氢氧化铝组(P＜0.05);但血中病毒的滴度低于氢氧化铝组(P＜0.05).弗氏佐剂组小鼠的生存率好于氢氧化铝组(P＜0.05).结论:采用肌肉注射途径,并联合弗氏佐剂或Montanide ISA 720佐剂可以使CVB3VP1免疫获得较好的免疫效果.     

162株鲍曼不动杆菌感染分布与耐药性分析

鲍曼不动杆菌是一种不发酵糖类的革兰阴性球杆菌,属于条件致病菌,广泛分布于自然界。其临床分离率仅次于铜绿假单胞菌,该菌获得多重耐药的速度很快,常导致严重的医源性感染如肺炎、菌血症或脑膜炎。近年来不动杆菌的感染和耐药有逐渐上升趋势。为了解邢台地区鲍曼不动杆菌在医院的感染情况,本研究收集了162株临床分离的鲍曼不动杆菌,对其标本类型分布、病区感染分布情况和17种抗生素敏感情况及部分菌株的同源性进行了分析。     

柯萨奇病毒B3的VP1 DNA疫苗与蛋白或重组腺病毒疫苗不同组合免疫方式的免疫效果观察

目的 观察柯萨奇病毒B3 (Coxsackievirus B3, CVB3)衣壳蛋白VP1 DNA疫苗初免后VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VP1加强的prime-boost策略的免疫效果。方法 用CVB3 VP1的真核表达质粒pcDNA3/VP1初次免疫小鼠后,分别用VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VP1加强免疫2次。检测免疫小鼠血清特异性IgG抗体、中和抗体滴度以及脾脏细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocytes,CTLs)杀伤活性;致死量CVB3攻击后,检测小鼠血中病毒滴度并观察动物的存活情况。结果 pcDNA3/VP1 +VP1蛋白组小鼠血清IgG抗体、中和抗体滴度以及动物生存率明显高于pcDNA3/VP1 + rAd/VP1组和pcDNA3/VP1质粒组（P<0.05）; pcDNA3/VP1 + rAd/VP1组和pcDNA3/VP1 +VP1蛋白组小鼠脾脏CTLs杀伤活性明显高于pcDNA3/VP1 质粒组（P<0.05）。结论 质粒pcDNA3/VP1初次免疫后,VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VP1加强的prime-boost策略有较好的免疫效果,两者比较pcDNA3/VP1 +VP1蛋白prime- boost免疫策略的效果更为明显。     

柯萨奇病毒B3VP1重组腺病毒载体疫苗rAd/VP22-L-VP1的构建及表达**

背景：VP22是单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)UL49基因编码的碱性蛋白质,具有蛋白转导结构域(protein transduction domain, PTD),能够把与之融合的蛋白或与之结合的DNA 等大分子跨膜送递到邻近细胞,在基因靶向预防中表现出优势。 目的：构建表达单纯疱疹病毒1型VP22与柯萨奇病毒B3主要中和抗原VP1融合蛋白的重组腺病毒载体疫苗,观察外源基因在HEK293细胞中的良好表达。 方法：PCR法扩增目的基因HSV-1 VP22和CVB3 VP1,经Linker连接,将VP22-L-VP1插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒AdTrack-CMV/VP22-L-VP1。再将此载体与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,生成重组腺病毒质粒pAd/VP22-L-VP1,脂质体介导pAd/VP22-L-VP1转染HEK293细胞包装重组腺病毒rAd/VP22-L-VP1。HEK293细胞上进行病毒扩增和滴定并检测外源基因的表达。 结果与结论：构建的重组腺病毒载体pAd/VP22-L-VP1经过第4轮扩增,其滴度达到6.77×107 pfu/mL,体外感染293细胞可见VP22和VP1融合蛋白的表达。说明实验成功构建并包装重组腺病毒rAd/VP22-L-VP1。     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1的构建及免疫效果研究

目的:构建巨噬细胞源趋化因子(Macrophage-derived chemokine,MDC)与柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)VP1融合基因腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1,并观察对小鼠的免疫效果.方法:利用AdEasy-1系统构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1及腺病毒Ad,并检测融合蛋白MDC-VP1的表达.BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组18只,分别肌肉注射Ad/MDC-VP1和Ad,免疫2次,间隔2周.分别用ELISA法和微量中和试验法检测血清CVB3 VP1特异性IgG抗体和中和抗体;末次免疫后3周,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击后检测小鼠血中病毒滴度并观察保护率.结果:Ad/MDC-VP1和Ad构建成功,并检测到MDC-VP1融合蛋白的表达.Ad/MDC-VP1组血清CVB3 特异性VP1 IgG、中和抗体水平、特异性CTL活性较对照组明显增强(P＜0.01);病毒攻击后实验组血中病毒滴度明显降低,生存率明显高于对照组(P＜0.01).结论:Ad/MDC-VP1能提高小鼠细胞和体液免疫水平,增加病毒攻击后的保护率.     

小鼠β防御素2与柯萨奇病毒B3 VP1融合基因疫苗的构建和免疫效果研究

目的:构建小鼠β-防御素2(Mouse beta-defensin-2,mBD2)与柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus B3,CVB3)VP1融合基因疫苗,并观察其对小鼠的免疫效果.方法:克隆mBD2基因,构建重组质粒pcDNA3/mBD2和pcDNA3/mBD2-L-VP1.将4～6周龄BALB/c雄性小鼠随机分为5组,分别于股四头肌注射PBS(A组)、pcDNA3(B组)、pcDNA3/mBD2(C组)、pcDNA3/VP1(D组)、pcDNA3/mBD2-L-VP1(E组),每次接种剂量100 μg/只,3周免疫1次,共3次.每次免疫后第14天眼眶静脉取血,用微量中和试验滴定血清中和抗体效价.第三次免疫后第21天,每组随机取3只小鼠,制备脾淋巴细胞悬液,用CCK-8细胞计数法检测特异性CTL的杀伤活性;每组取3只小鼠以3LD50 CVB3病毒攻击,第7天取血处死,检测血清病毒滴度.结果:成功克隆了mBD2基因,构建了pcDNA3/mBD2和pcDNA3/mBD2-L-VP1两种重组质粒;D组和E组血清中和抗体滴度随免疫次数增加而提高(P＜0.01);E组血清中和抗体滴度和脾细胞特异性CTL杀伤活性显著高于其他组(P＜0.01),血中CVB3病毒滴度显著低于其他组(P＜0.01).结论:pcDNA3/mBD2-L-VP1能诱导小鼠对CVB3产生较强的体液免疫和细胞免疫,能有效抑制病毒在体内增殖.