甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)的残余毒力及其返祖可能性的研究

甲型肝炎是我国广泛流行的急性传染病。我所与浙江省医科院合作,于1992年研制成功H2株甲肝减毒活疫苗,该疫苗是我国首创,国际领先。疫苗推广使用以来,全国甲肝发病率有了明显下降,取得了显著的社会效益及经济效益。疫苗病毒的毒力返祖可能性是活疫苗全面推广应用中极为关键的问题,本课题对此进行了深入研究,取得了富有理论及实用价值的结果。     

甲型肝炎减毒活疫苗病毒的水平传播

目的 探讨甲型肝炎（甲肝）减毒活疫功接种后的病毒水平传播。方法 在昆明市安宁县2个观察点筛选出丙氨酸转氨酶（ALT）正常、甲肝（HAV）抗体（抗－HAV）阴性的4－7岁儿童199人,按1：1.4比例分接种组（82人）和接触组（117人）进行H2株甲肝减毒活疫苗病毒的水平传播观察;另外,取接种者和接触者HAV检测阳性的粪便悬液上清,分别静脉接种于8普通狨猴（Callithrix jacchus）体内,观察粪便HAV毒力水平。结果 接种组接种后6周抗体阳转率为97.6％（80／82）,接触组9周时抗体阳转率为13.7％（16／117）,两组儿童肝功能均未见异常 种组和接触组的粪便HAV检出率分别为89.5%(34/38)和70.7%(53/75）;以2株接种者粪便HAV和2株接触者粪便HAV感染的8只狨猴,均未检出血清酶升高和肝脏组织病理学改变,抗－HAV和2株接触者粪便HAV感染的8只狨猴,均未检出血清酶升高和肝脏组织病理学改变,抗－HAV阳转时间延迟且效价低。结论 H2株甲肝减毒活安全性及免疫原笥良好,疫苗病毒在人体内增殖活跃,且保持减毒性能稳定,能在人群中造成水平传播,但不会引发甲肝。     

Protein A/G亲和层析在HCV抗体纯化中的应用效果

目的分析蛋白A/G亲和层析柱在纯化抗HCV血清的影响因素,以便选择最佳使用条件提高Protein A/G亲和柱的利用效率。方法分别将抗HCV血清用不同处理方式、不同上样方式、不同使用次数的亲和柱进行纯化,并收集纯化样品进行检测、分析。 结果用饱和硫酸铵粗纯后,在蛋白A/G亲和层析柱的纯化效果更好;样品在亲和柱内吸附30min可提高亲和柱的对目的蛋白的吸附。 结论使用初纯的抗体并增加吸附时间能提高亲和层析柱的利用率,并有效延长亲和柱的使用寿命。     

用核酸序列分析鉴别甲肝病毒疫苗株与野毒株

目的鉴别在接种甲肝减毒活疫苗（Ｈ２株）后２３天发生的一例甲型肝炎,其病原体是疫苗株还是野毒株。方法用细胞培养、ＩＥＭ等确认病原体,接种普通狨猴检定病毒毒力,测定核苷酸序列分析病毒基因型。结果甲型肝炎的确诊依据有：抗ＩｇＭ（＋）,双份血清ＨＡＶ总抗体效价１６倍增长以及粪便排出ＨＡＶ（郑株）。该粪便悬液攻击普通狨猴后,肝脏呈现持续性组织病理改变,证明郑株是强毒ＨＡＶ。郑株的３个片段共１３７７个核苷酸序列分析表明,与１９８８年上海甲肝流行株合－５２的同源性高达（９８．３０～９９．４０）％,判定为ＩＡ基因亚型,与Ｈ２株疫苗病毒的基因亚型不同。结论该例甲型肝炎是接种甲肝减毒活疫苗中交叉感染野毒株引发的偶合病例,与疫苗接种无关     

免疫复合物解离剂的研究及在HCV抗原检测中的应用效果分析

目的探索一种可以使免疫复合物发生解离的方法,并进行应用效果分析。方法通过对HAV抗原抗体复合物的解离,进行酸化剂、去垢剂的组合及解离时间、温度等相关条件筛选,优化出最佳的解离方法,应用于1 370份HCV血清样品,对解离前后的抗原阳性率进行统计分析。结果 160 EU/ml的HAV抗原能被效价为20 U/ml的HAV抗血清完全中和;只单独使用去垢剂对免疫复合物无解离效果;0.1 mol/LGly-HCL能解离抗原抗体复合物,加入1种或几种去垢剂后则其解离效果有不同程度的提高,其中以Gly-HCl+7%TritonX-100+5%CHAP的效果最好(q=27.177,P<0.01);免疫复合物在加入解离剂后在室温60 min、37℃30 min、60℃10 min为本试验较好的解离条件,其中以37℃30 min效果最佳;应用Gly-HCl+5%CHAPS+7%TritonX-100在37℃对样品进行预处理30 min后,可使HCV抗原阳性检出率由解离前的33.3%提升至75.56%,解离前后之间的阳性率差异具有显著地统计学意义(χ2=32.34,P<0.01)。结论酸化剂能将HAV及HCV抗原抗体免疫复合物解离,添加去垢剂后,解离效果好于单独使用酸化剂,且联合添加好于单独添加。     

HCV抗原ABS-ELISA检测方法的建立及初步评价

目的 建立新的HCV抗原生物素-亲和素-酶联免疫检测方法(ABS-ELISA).方法 将生物素-亲和素系统与酶联免疫技术相结合,建立用于丙型肝炎病毒抗原检测的方法,分析检测方法的灵敏度、特异度、稳定性及精确度等主要技术指标,并对应用效果进行评价.结果 建立的检测方法,对40余种肠道病毒样品均无交叉反应,在第二代HCV-RNA国家标准品的10份阴性标准品中,未检出HCV-Ag阳性样品,在10份HCV-RNA阳性标准品中,检出6份HCV-Ag阳性的样品,表现出良好的特异性；检测试剂CV平均值为6.28％,精密性好；在90份HCV抗体阳性样品中检测出HCV-RNA样品67份(74.44％),检出HCV游离抗原阳性样品30份(33.33％)、HCV总抗原阳性样品68份(75.56％),HCV游离抗原与HCV-RNA两个指标检出率差异有统计学意义(x2=22.443,P＜0.01),但HCV总抗原与HCV-RNA检测结果之间差异无统计学意义(x2=0.037,P＞0.05)；以HCV-RNA检测试剂为金标准,所建立的ABS-HCV抗原检测试剂总抗原检测结果的一致性、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为98.03％、80.60％、98.93％、79.41％、99.00％.结论 新建立的HCV抗原ABS-ELISA检测方法特异性好,其灵敏度与荧光定量PCR相近.     

甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检测方法的研究及应用

目的建立甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检测方法。方法用双抗体夹心ELISA法检测试剂对甲型肝炎灭活疫苗及效力试验参比进行检测,以检测OD值为反应指标,用生物检定双平行线法的基本原理进行统计分析,计算待检疫苗对应于效力参比品的相对效力（R值）。结果样品HAAg含量与检测OD值之间具有高度的相关性,R2≥0.97,适用于建立双平行线检定方法;通过对3批样品3人次检测结果分析,验证了所建立方法的可靠性,回归、偏离平行、二次曲线、反二次曲线4个指标全部通过了验证;用所建立的体外相对效力试验检测法对32批次甲肝灭活疫苗进行检测,结果与小鼠体内效力检测结果具有良好一致性,均能反映疫苗相对效力,两种方法检测相对效力（R值）之间无明显差别（t=1.0354,P=0.3045）。结论所建立的甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力试验是一种灵敏、特异、方便、快捷的效力测定方法,可应用于甲型肝炎灭活疫苗效力检测。