固醇调控核因子bHLH-Zip的原核表达及其抗血清的制备

[目的]制备固醇调控核因子bHLH-Zip片段及其多克隆抗血清,为细胞固醇代谢及调脂药物研究提供材料。[方法]将人源固醇调节元件结合蛋白SREBP的N端第323-553位氨基酸残基的基因序列即bHLH-Zip片段克隆到表达载体pcDNA4/hismaxA,得到重组质粒pHis-bHLH-Zip,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达;裂解细菌并纯化目的蛋白;用纯化后的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗血清,采用间接ELISA法测定效价。[结果]获得纯化bHLH-Zip片段,并制备其多克隆抗血清。抗bHLH-Zip抗血清的效价为1:16000。[结论]bHLH-Zip核因子是一段可溶性蛋白,并可制备产生具有较高效价的多克隆抗血清,这为研究细胞固醇代谢及调脂药物对SREBP通路的影响奠定了基础。     

胶质瘤细胞中ADAR2 mRNA前体选择性剪接模式的分析

  目的   比较胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中ADAR2 mRNA前体选择性剪接模式的差异。  方法  RFPCR产物测序检测胶质瘤细胞和正常胶质细胞中GluR2 Q/R位点的A-to-I编辑水平。根据前期研究鉴定出的选择性剪接位点设计特异性引物,RT-PCR方法检测胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中不同剪接转录本的相对表达量,比较胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中ADAR2 mRNA前体剪接模式的差异。  结果  胶质瘤细胞中GluR2 Q/R位点的A-to-I编辑水平明显下降。RT-PCR检测到在胶质瘤细胞中,Exon 1a（+）/1a（-）、Exon 2（+）/2（-）的比值在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中无显著性差异。Exon 5a（+）/5a（-）的比值明显高于正常星形胶质细胞HA1800。  结论  Exon 5a位点的剪接在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中有显著性差异,Exon 5a（+）转录本的表达增加可能是导致胶质瘤细胞中ADAR2编辑活性下降的原因。      

莪术醇下调FoxD2-AS1逆转胶质瘤细胞替莫唑胺化疗耐药的作用研究

[目的]初步明确长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)Fox D2-AS1与胶质瘤替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)耐药的关系,并探索莪术醇逆转胶质瘤替莫唑胺耐药与Fox D2-AS1基因表达的相关性。[方法]以生物信息学分析胶质瘤lncRNA表达谱;以胶质瘤A172、U251细胞系为研究对象,采用药物浓度递增法建立耐药细胞系A172/TMZ、U251/TMZ;以流式细胞术检测干扰Fox D2-AS1对耐药细胞凋亡的影响;莪术醇以不同浓度和时间梯度处理耐药细胞后,以Hoechst染色观察细胞形态变化,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测不同浓度莪术醇处理后耐药细胞中Fox D2-AS1的表达水平。[结果]lncRNA Fox D2-AS1在胶质瘤患者瘤体组织中高表达,其高表达与患者总生存率呈负相关;敲除Fox D2-AS1可显著增加耐药细胞对TMZ的敏感性并促进细胞凋亡,诱导细胞周期发生S和G2/M期阻滞;莪术醇和TMZ联用显著增加耐药细胞凋亡的典型变化。RT-qPCR结果显示,莪术醇处理后耐药细胞内Fox D2-AS1的含量明显下降,且具有浓度和时间依赖性。[结论]敲除Fox D2-AS1基因可以逆转胶质瘤细胞TMZ耐药。莪术醇可抑制胶质瘤耐药细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性,其作用机制与下调Fox D2-AS1基因表达有关。     

佛手柑内酯通过PI3K/Akt信号通路诱导人肝癌细胞HepG2和Hep3B凋亡的机制

目的:探究佛手柑内酯通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路诱导人肝癌细胞Hep G2和Hep3B凋亡的机制。方法:设立佛手柑内酯(5,50,200μmol·L~(-1))组和空白组;采用噻唑蓝(MTT)比色法检测佛手柑内酯作用Hep G2和Hep3B细胞24,48 h细胞增殖;磷脂结合蛋白V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染检测细胞凋亡;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time PCR)及蛋白免疫印迹法(Western bolt)检测相关m RNA和蛋白的表达含量;进行平板细胞克隆形成实验评价各组Hep G2和Hep3B细胞的克隆形成率与效果。结果:MTT实验表明,佛手柑内酯能明显抑制Hep G2和Hep3B细胞的增殖活性,且呈浓度依赖性;流式细胞仪分析结果表明,佛手柑内酯200μmol·L~(-1)组作用于Hep G2和Hep3B细胞48 h,有明显促凋亡作用(P 0. 05); Western blot结果显示,佛手柑内酯可以上调半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3,Caspase-8蛋白表达量(P 0. 05),并且下调B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),PI3K蛋白表达(P 0. 05); Real-time PCR显示PI3K,Akt m RNA相对表达量降低(P 0. 05);平板细胞克隆形成实验的结果显示,随着佛手柑内酯浓度的增加,各组细胞克隆形成率呈递减趋势,且佛手柑内酯200μmol·L~(-1)组作用降低明显(P 0. 05)。结论:佛手柑内酯对人肝癌细胞Hep G2和Hep3B的增殖存在抑制作用,其可能是通过PI3K/Akt信号通路诱导Hep G2和Hep3B细胞的凋亡。     

miR-3175/SIX5轴调节神经胶质瘤细胞的增殖和迁移

[目的]探讨miR-3175在胶质瘤细胞中的表达,以及对胶质瘤细胞增殖和迁移能力的影响及相关作用机制.[方法]采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR)检测胶质瘤细胞与人正常胶质细胞中miR-3175的...     

miRNA与常见肝病发生发展关系的研究进展

[目的]综述近10年来miRNA与常见肝病发生发展关系的研究进展。[方法]通过文献检索,查阅2003年以来发表的有关miRNA与相关肝病临床研究的文献,总结综述miRNA在肝脏疾病中的调控机制。[结果]miRNA作为转录后水平调节基因,参与机体的各种重要的生理和病理过程。近年发现,miRNA参与调控多种肝病相关基因,其表达量在原发性肝细胞癌、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、酒精性与非酒精性脂肪肝病等常见肝病的发生发展过程中的有着不同程度的改变。其中部分miRNA的作用机制已经相当明确,暗示一些miRNA可作为相关肝病的治疗靶点应用于临床。[结论]miRNA在肝脏疾病中的调控机制对于肝病的预防和治疗有着重要意义。这些miRNA的发现,为常见肝病的检测,预防,治疗提供了新的思路。但其表达调控网络、生物学功能及其与疾病的关系等仍有许多问题亟待阐明,尚有待做更深入的研究。     

宫颈癌患者周围神经侵犯的临床研究

目的 探讨宫颈癌周围神经侵犯(PNI)对预后的影响及其在维吾尔族和汉族间的差异.方法 回顾性分析2009～2014年413例宫颈癌(Ⅰb～Ⅱb期)根治术术后患者的临床病理资料.其中维吾尔族患者198例,汉族患者215例.研究宫颈癌PNI与其他临床病理特征的关系及其对宫颈癌预后的意义.结果 宫颈癌PNI的患者共有33例,其与淋巴结转移,肿块大于或等于4 cm,宫旁侵犯及脉管癌栓均相关(P＜0.05).PNI阳性组的5年无复发生存率为76.7％,明显低于阴性组84.6％,差异有统计学意义(P=0.048).PNI阳性组与阴性组的5年生存率分别为70.6％和79.9％,差异无统计学意义(P=0.383).维吾尔族患者中PNI阳性亚组的5年无复发生存率明显低于PNI阴性亚组,差异有统计学意义(P=0.034).Cox多因素分析显示,PNI不是影响宫颈癌术后患者生存的独立预后因素(P＞0.05).结论 宫颈癌PNI降低患者5年无复发生存率,且在维吾尔族患者中显著,但其不能作为判断宫颈癌预后的独立指标.     

Bcl-x mRNA 前体剪接转换寡核苷酸诱导胶质瘤细胞凋亡的实验研究

  目的  探讨Bcl-x mRNA前体剪接转换寡核苷酸（Bcl-x splice-switching oligonucleotides，Bcl-x SSO）对胶质瘤细胞株U251 增殖和凋亡的影响。  方法  设计靶向 Bcl-x基因下游选择性 5'端剪接位点的 Bcl-x SSO，β-globin SSO 作为阴性对照 SSO。SSO经2'-甲氧乙基（2'-O-methoxyethyl，MOE）、全硫代磷酸化（phosphorothioate，PS）修饰。采用阳离子脂质体将不同的SSO转染至U251细胞。采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）检测Bcl-x SSO对U251细胞的增殖抑制率。流式细胞术定量检测U251细胞的凋亡率。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测Bcl-x SSO对Bcl-xL、Bcl-xS mRNA表达水平的影响，Western blot方法检测Bcl-x SSO对Bcl-xL、Bcl-xS蛋白表达的影响。  结果  MTT结果显示Bcl-x SSO显著抑制U251细胞的增殖，且抑制作用呈剂量依赖性。流式细胞术检测 Bcl-x SSO 能够明显促进 U251 细胞凋亡。RT-PCR 检测 Bcl-x SSO 处理组 Bcl-xL mRNA 表达水平下降，Bcl-xS mRNA表达水平升高。Western blot检测Bcl-x SSO处理组Bcl-xL蛋白表达水平下降，Bcl-xS蛋白表达水平升高。  结论  在胶质瘤细胞U251中，Bcl-x SSO可特异性的作用于Bcl-x mRNA前体，调节其选择性剪接模式从Bcl-xL转换至Bcl-xS，进而促进U251细胞凋亡。      

Lin28与肝癌细胞紫杉醇耐药关系的研究

[目的]Lin28是一种重编程因子和保守的RNA结合蛋白,存在Lin28A和Lin28B两种同源基因,两者结构和功能类似。本研究旨在探讨Lin28与肝癌细胞对紫杉醇耐药的关系。[方法]MTT法检测紫杉醇对HepG2、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞的IC50;用荧光定量PCR法（简称RTPCR）在RNA水平检测Lin28A和Lin28B在Hep3B、HepG2、SMMC-7721中的表达,蛋白质印迹法分析Lin28A和Lin28B蛋白在Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞中的表达情况。[结果]Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞株对紫杉醇的IC50分别为：Hep3B为0.194μM、HepG2为19.54μM、SMMC-7721为0.444μM。HepG2、SMMC-7721细胞株中的Lin28A基因表达量分别是Hep3B的5.06、3.10倍;HepG2、SMMC-7721细胞株中的Lin28B基因表达量分别是Hep3B的7.16、3.16倍。Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞株中Lin28A和Lin28B蛋白的表达量与从荧光定量数据显示的趋势一致。[结论]Lin28与肝癌细胞对紫杉醇耐药密切相关,肝癌细胞中Lin28表达与肝癌细胞对紫杉醇的耐药性成正比,暗示Lin28表达可能是肝癌细胞紫杉醇耐药的潜在机制并有望成为逆转肝癌紫杉醇耐药的靶点。