刺五加GAPDH基因的克隆及序列分析

目的 对刺五加Eleutherococcus senticosus GAPDH基因进行克隆及序列分析,使其成为可用的内参照基因。方法 采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,运用RT-PCR法克隆GAPDH基因的部分序列,并以其为内参照基因进行半定量PCR。结果 克隆了长度为627 bp的刺五加GAPDH基因,推测其编码209个氨基酸,与三七、人参、拟南芥的GAPDH氨基酸序列同源性分别为97%、93%、93%,核苷酸同源性分别为94%、86%、84%。其作为内参照基因的半定量PCR具有良好的扩增效果和重现性。结论 首次分离并克隆了刺五加GAPDH cDNA,证实该序列可以作为基因表达分析的内参照基因,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机制研究奠定基础。     

刺五加鲨烯合酶和鲨烯环氧酶基因单核苷酸多态性及其与总皂苷量的相关性研究

目的 筛选刺五加鲨烯合酶(SS)和鲨烯环氧酶(SE)基因存在的单核苷酸多态性(SNP)位点,分析各SNP位点与刺五加总皂苷量的相关性.方法 采用分光光度法测定刺五加总皂苷的量,并划分为具有显著差异(P＜0.01)的高、低量组;RT-PCR法扩增刺五加SS、SE基因,根据测序结果筛选SNP位点,利用R×C表的x2检验分析相关关系.结果 刺五加SS基因存在6处SNP,其中704 bp位点为错义突变,其他位点为同义突变,各位点均不与刺五加总皂苷量显著相关.SE基因存在9处SNP,其中导致错义突变的164、199、227、232 bp位点及同义突变的279、285 bp位点与刺五加总皂苷量显著相关(P＜0.05),其他位点为同义突变,与刺五加总皂苷量间无显著相关性.结论 刺五加SS和SE基因存在SNP,SE基因164～285 bp位点的AGAACG与刺五加总皂苷高量组显著相关,TAGTTC与低量组显著相关.     

刺五加亚精胺合成酶基因的克隆及内生真菌对其表达的影响

目的 克隆刺五加亚精胺合成酶(spermidine synthase,SPDS)基因,并分析内生真菌对其表达的影响.方法 采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加SPDS基因全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析.RT-PCR法检测内生真菌菌株P116-1a、P116-1b、P109-4和P312-1对SPDS基因表达的影响.结果 刺五加SPDS基因的cDNA全长为1 541 bp,开放阅读框长1 002 bp,编码333个氨基酸的蛋白,包含SPDS家族的基本结构和标志性序列.RT-PCR结果显示,内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达量(P＜0.05),最大表达量出现在菌株P116-1b回接90 d时,是对照的2.06倍.结论 首次克隆了刺五加SPDS基因的cDNA全长序列,并证实内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达,为阐明内生真菌提高刺五加三萜皂苷量的机制及刺五加的抗逆性改良奠定了基础.     

内生真菌对刺五加皂苷合成关键酶基因表达及 皂苷含量的影响

目的:分析刺五加内生真菌菌株P116-1a,P116-1b,P109-4,P312-1对刺五加中皂苷合成关键酶基因SS(squalenesynthase),SE(squalene epoxidase),bAS(β-amyrin synthase)表达量和皂苷含量的影响。方法:伤口法回接内生真菌。以GAPDH为内参照基因,Real time PCR法检测关键酶基因表达量的变化。分光光度法测定刺五加的总皂苷含量。结果:回接P116-1a和P116-1b 30 d,刺五加SS基因的表达量显著提高(P<0.05),P109-4和P312-1无显著变化,之后出现降低-相等-降低的变化趋势。回接菌株P312-1 30 d,刺五加SE的表达量显著提升(P<0.05),回接菌株P116-1b和P312-1 90 d,SE的表达量分别显著提升至对照的130%,161%(P<0.05)。回接120 d,4个菌株处理的SE表达量均显著高于对照(P<0.05)。各处理bAS的表达量在回接60～120 d时均显著高于对照(P<0.05)。4个菌株均显著提高了刺五加的皂苷含量(P<0.05)。结论:菌株P116-1a,P116-1b,P109-4,P312-1可显著影响刺五加SS,SE,bAS的表达量,进而影响刺五加的皂苷含量,其中bAS为主要靶点基因。     

刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、 生物信息学及表达分析

目的:克隆刺五加的法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加FPS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能.并通过RT-PCR法检测FPS在不同器官中的表达情况.结果:刺五加FPS基因的cDNA全长为1 499 bp,开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸的蛋白,包含2个富含天冬氨酸(DDXXD)的保守功能域.FPS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加FPS基因在各器官中均有表达,但表达最具有显著差异(P＜0.05).结论:首次分离并报道了刺五加FPS的cDNA克隆,并证实其在不同器官中的表达量不同,为进一步研究FPS对刺五加皂苷合成的影响和表达调控奠定了基础.     

刺五加与其愈伤组织中皂苷合成关键酶基因表达的差异分析

目的:分析刺五加叶片、叶柄及其愈伤组织中SS、SE和bAS基因表达量的差异。方法:以刺五加叶片和叶柄为外植体,诱导获得愈伤组织。实时荧光定量PCR检测SS、SE和bAS基因的表达量。结果:刺五加SS、SE和bAS基因在刺五加叶片、叶柄及其愈伤组织中都有表达,SS、SE和bAS基因在叶片愈伤组织中的表达量分别为叶片中的89.3%、73.8%和83.4%,在叶柄愈伤组织中的表达量分别为叶柄中表达量的80.2%、87.7%和70.9%。结论:刺五加愈伤组织中SS、SE和bAS基因的表达量显著低于植株中的表达量。     

刺五加鲨烯合酶和鲨烯环氧酶基因单核苷酸多态性及其与总皂苷量的相关性研究

目的 筛选刺五加鲨烯合酶（SS）和鲨烯环氧酶（SE）基因存在的单核苷酸多态性（SNP）位点,分析各SNP位点与刺五加总皂苷量的相关性。方法 采用分光光度法测定刺五加总皂苷的量,并划分为具有显著差异（P＜0.01）的高、低量组;RT-PCR法扩增刺五加SS、SE基因,根据测序结果筛选SNP位点,利用R×C表的χ²检验分析相关关系。结果 刺五加SS基因存在6处SNP,其中704 bp位点为错义突变,其他位点为同义突变,各位点均不与刺五加总皂苷量显著相关。SE基因存在9处SNP,其中导致错义突变的164、199、227、232 bp位点及同义突变的279、285 bp位点与刺五加总皂苷量显著相关（P＜0.05）,其他位点为同义突变,与刺五加总皂苷量间无显著相关性。结论 刺五加SS和SE基因存在SNP,SE基因164～285 bp位点的AGAACG与刺五加总皂苷高量组显著相关,TAGTTC与低量组显著相关。     

刺五加GAPDH基因的克隆及序列分析

目的对刺五加Eleutherococcus senticosus GAPDH基因进行克隆及序列分析,使其成为可用的内参照基因。方法采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,运用RT-PCR法克隆GAPDH基因的部分序列,并以其为内参照基因进行半定量PCR。结果克隆了长度为627 bp的刺五加GAPDH基因,推测其编码209个氨基酸,与三七、人参、拟南芥的GAPDH氨基酸序列同源性分别为97%、93%、93%,核苷酸同源性分别为94%、86%、84%。其作为内参照基因的半定量PCR具有良好的扩增效果和重现性。结论首次分离并克隆了刺五加GAPDH cDNA,证实该序列可以作为基因表达分析的内参照基因,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机制研究奠定基础。     

高效液相色谱测定不同生境黄芩中的黄芩苷

目的:测定不同生境条件下,黄芩根、茎和叶中黄芩苷的含量.方法:采用HPLC,Kromasil ODS柱(4.6 mm×250mm,5μm),以甲醇-水(53∶47)为流动相,检测波长280 nm,线性范围0.124～0.93 μg,r =0.999 9,平均回收率98.17％,RSD1.3％(n=6).结果:不同生境下黄芩根的黄芩苷平均含量分别为6.79％,6.01％,5.49％,3.50％,4.38％、茎的黄芩苷平均含量分别为0.10％,0.08％,0.09％,0.06％,0.03％;叶的黄芩苷平均含量分别为0.27％,0.26％,0.15％,0.14％,0.09％.结论:本方法简便快速,稳定可靠,重现性好.相同产地不同生境中的黄芩及黄芩不同器官的黄芩苷含量间存在显著差异.     

刺五加亚精胺合成酶基因的克隆及内生真菌对其表达的影响

目的 克隆刺五加亚精胺合成酶（spermidine synthase,SPDS）基因,并分析内生真菌对其表达的影响。方法 采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术克隆刺五加SPDS基因全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析。RT-PCR法检测内生真菌菌株P116-1a、P116-1b、P109-4和P312-1对SPDS基因表达的影响。结果 刺五加SPDS基因的cDNA全长为1 541 bp,开放阅读框长1 002 bp,编码333个氨基酸的蛋白,包含SPDS家族的基本结构和标志性序列。RT-PCR结果显示,内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达量（P＜0.05）,最大表达量出现在菌株P116-1b回接90 d时,是对照的2.06倍。结论 首次克隆了刺五加SPDS基因的cDNA全长序列,并证实内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达,为阐明内生真菌提高刺五加三萜皂苷量的机制及刺五加的抗逆性改良奠定了基础。