软骨细胞上清液诱导骨髓间充质干细胞分化的软骨细胞的形态学及功能检测

摘 要］目的：应用家兔肋软骨细胞上清液诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向软骨细胞定向分化,并对分化的细胞进行形态学和功能检测,探讨MSCs在体外成软骨分化的条件。方法：分离家兔的MSCs和肋软骨细胞进行体外培养,收集前3代肋软骨细胞上清液作为诱导液,对第3代MSCs进行14 d的诱导培养。设置实验组、阳性对照组和阴性对照组,观察各组细胞的形态,甲苯胺蓝染色观察特异性蛋白表达、各组ALP活性,RT-PCR法检测各组细胞中的Ⅱ型胶原(ColⅡ) mRNA的表达。结果：经过14 d的诱导培养,实验组MSCs由长梭形逐渐变成多角形,甲苯胺蓝染色呈阳性;ALP活性显著升高,与其他2组比较差异有统计学意义(P＜0.01）;ColⅡ mRNA表达呈阳性。阴性对照组甲苯胺蓝染色呈阴性,ColⅡ mRNA表达呈阴性。阳性对照组甲苯胺蓝染色呈阳性,ColⅡ mRNA表达呈阳性。结论：家兔肋软骨细胞上清液能够促进MSCs向软骨细胞方向分化。     

贞芪扶正颗粒HPLC指纹图谱与其增强免疫功能的谱效关系分析

目的 通过谱效相关性分析探究贞芪扶正颗粒增强免疫功能的药效物质成分，为提升其质量标准提供实验依据。方法 收集6个厂家18批贞芪扶正颗粒产品，采用高效液相色谱法（HPLC）建立其指纹图谱，流动相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脱（0~15 min，5%A；15~23 min，5%~8%A；23~30 min，8%~11%A；30~45 min，11%~18%A；45~60 min，18%~21%A；60~67 min，21%~23%A；67~90 min，23%~37%A），检测波长220 nm，通过相似度分析及层次聚类分析评价不同厂家产品的质量差异性，采用环磷酰胺诱导小鼠免疫低下模型考察不同厂家产品的免疫增强药效，采用Spearman双变量相关性分析进行指纹图谱与免疫增强功能的谱效学研究，利用高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MSⁿ）对谱效相关色谱峰进行鉴定，采用电喷雾离子源，正、负离子模式，扫描范围m/z 100~1 500。结果 建立了贞芪扶正颗粒的HPLC指纹图谱，确定了20个共有峰。质量分析及药效考察结果显示，不同厂家产品共有峰峰面积及药效作用差异明显；谱效相关性分析结果显示，指纹谱图中的12个色谱峰与该制剂具有免疫增强功能呈明显正相关，鉴定了其中8个色谱峰，分别为2号峰（红景天苷）、5号峰（松果菊苷）、6号峰（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、7号峰（特女贞苷异构体）、9号峰（异女贞苷）、11号峰（毛蕊异黄酮）、14号峰（女贞苷G₁₃或oleonuezhenide）和18号峰（刺芒柄花素）。结论 不同厂家生产的贞芪扶正颗粒产品质量及药效存在一定差异，通过谱效相关性分析阐明了该制剂具有免疫增强功能的主要药效物质基础，可为其质量标准提升提供有益借鉴。