hβ-arrestin2基因重组质粒构建及蛋白表达和定位

目的:构建pEGFP-C1-β-arrestin2融合蛋白表达载体,并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:以pGEX-5X-1-β-arrestin2为模板,PCR法扩增hβ-arrestin2编码序列,亚克隆至pEGFP-C1中,pEGFP-C1-β-arrestin2经双酶切初步鉴定再送测序公司检测正确后瞬时转染人胚肾细胞HEK293,Western blot检测融合蛋白表达。激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白在HEK293细胞中的分布。结果:hβ-arrestin2编码序列被成功克隆至pEGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为77kDa,pEGFP-C1-β-arrestin2定位于HEK293细胞的细胞质中。结论:成功构建hβ-arrestin2基因真核表达载体,证实了融合蛋白定位在HEK293的细胞质中。     

高GC hTwist表达载体构建及其表达条件优化

 目的 构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法 以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物。本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist,并转化E.coli DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx 加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实：我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist。诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论 上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定了基础。     

h-arrestin1重组蛋白不同亚型筛选及互作鉴定

 目的 构建GST/-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础。方法 提取人结肠癌细胞SW480的mRNA,反转录为cDNA。用PCR法扩增h?-arrestin1全长编码基因,通过SalI和NotI酶切位点将h?-arrestin1全长定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达载体pGEX-5X-1-?-arrestin1,并通过BglⅡ单酶切筛选A、B亚型,然后将重组质粒转入E.coli BL21 中,异丙基硫代β-D 半乳糖苷诱导表达,用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST/?-arrestin1A、B, SDS-PAGE鉴定,互作实验比较亚型的结合能力。结果 酶切及测序结果证明,成功构建了?-arrestin1A、B原核表达载体,并通过SDS-PAGE证实：经IPTG诱导表达及亲和纯化,从转化重组质粒的BL21菌株中获得了融合蛋白GST/?-arrestin1A、B亚型,通过GST Pulldown初步比较了重组?-arrestin1A、B蛋白亚型的结合能力结论 成功构建pGEX-5X-1-?-arrestin1A、B原核表达载体并确定了融合蛋白的诱导表达及纯化方法,且互作实验显示?-arrestin1A有较强的结合能力,为进一步研究?-arrestin1的生物学功能奠定了基础。     

高GChTwist融合蛋白载体构建及其表达条件优化

目的 构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备.从而进一步研究其生物学功能.方法 以胃癌细胞系SGM7901cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物.本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X- 1-Twist,并转化E.coli DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Westem blot鉴定.结果 通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实:我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist.诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化,得到高纯度的融合蛋白.结论 上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定基础.     

N端标记GFP-TFF3蛋白在非洲绿猴肾成纤维细胞表达和定位

目的构建pEGFP-N1-TFF3融合蛋白表达载体,并检测其在非洲绿猴肾成纤维细胞(COS7细胞)内的表达和定位。方法提取HT29细胞的mRNA,反转录为cDNA;以此为模板PCR扩增hTFF3(286bp-462bp)基因;通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切位点将hTFF3基因定向插入真核表达载体pEGFP-N1中;将构建的重组质粒测序成功后,转染至人肾细胞(HEK293细胞)中,荧光显微镜观察GFP-TFF3融合蛋白的表达,并提取蛋白进行Western Blot检测;利用激光扫描共聚焦显微镜观察GFP-TFF3融合蛋白在COS7细胞内的定位情况。结果酶切及测序结果证明hTFF3基因成功克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,Western Blot检测结果显示其融合蛋白分子量约为34kDa,激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示GFP-TFF3融合蛋白在COS7细胞内定位以细胞核为主,在细胞质内少量表达。结论成功构建了pEGFP-N1-TFF3真核表达载体,GFP-TFF3蛋白定位于COS7的细胞核和细胞质中。     

转化细胞内质网分布—可能的蛋白出胞新模式

目的 :探讨细胞诱发转化中内质网的生物学特性。方法 :利用改进的整装培养细胞内质网技术对转化状态下的细胞内质网及固定细胞内质网超微结构进行观察。结果 :显示细胞的内质网由正常的网状转变为链锁状 ,发育不良 ,且在伪足及细胞边缘可见内质网结构及其独支盲端。结论 :从新的角度证实癌变细胞的内质网生物学特点及癌变细胞蛋白质运输经由内质网直接出胞的可能性     

人IKKγ基因重组载体的构建及在原核体内的表达纯化

目的构建重组原核表达载体pGEX-5X-1-IKKγ,诱导GST-IKKγ融合蛋白的表达并以GST-pulldown方法得到纯化的融合蛋白。方法应用PCR技术,以M6P8载体为模板扩增得到IKKγ全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5X-1载体中。经酶切、测序鉴定后,重组载体转化至原核细胞中并进行诱导表达,以SDS-PAGE凝胶电泳染色鉴定融合蛋白的表达。融合蛋白经GSTbeads沉降后,Western blot分析、鉴定融合蛋白的表达及纯化情况。结果将人IKKγ亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-1,酶切、测序鉴定无误。经诱导得到高表达的融合蛋白,经SDS-PAGE电泳染色后可见高表达条带。Westernblot鉴定经GSTbeads沉降后的蛋白,在74kD鉴定出融合蛋白的特异性条带。结论成功构建了原核表达载体pGEX-5X-1-,并在原核细胞内表达,融合蛋白可以经GSTbeads沉降用于GST-pulldown实验。     

hTFF3基因真核表达载体构建及表达鉴定

 目的克隆人肠三叶因子基因hTFF3,构建重组真核表达载体pEGFP-C1-TFF3,并在真核细胞中表达。方法应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术,从真核细胞中扩增得到人TFF3的全长序列,克隆至表达增强型绿色荧光蛋白载体中,经酶切、PCR鉴定后测序证实克隆成功。将重组载体转至真核细胞,荧光显微镜观察下转染效率,同时采用RT-PCR、Western blot技术检测外源基因TFF3的表达。结果成功将hTFF3基因克隆到真核表达载体中,酶切片段与预期大小一致（200 bp）。在荧光显微镜下观察转染后的细胞可见明显的绿色荧光,RT-PCR及Western blot结果表明：转染后的细胞中TFF3 在转录和翻译水平的表达均有明显提高。结论成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-TFF3,并在真核细胞中显著表达,为进一步研究TFF3 因子的生物学功能奠定了基础。     

人源MAP3K7克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

 目的构建MAP3K7 蛋白GST 的融合表达载体,高效表达和纯化GST-MAP3K7 融合蛋白,为GST Pulldown 实验做准
备。方法通过PCR扩增MAP3K7全长编码基因,经双酶切定向克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建原核重组表达载体pGEX-
5X-1-MAP3K7,通过酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21 宿主菌中,IPTG 诱导表达融合蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达
产物,SDS-PAGE 和Western blot 分析鉴定。结果经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,诱导后的
GST 融合蛋白经SDS-PAGE 和Western blot 检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论
成功构建了MAP3K7全长的GST 重组表达载体,确定了GST-MAP3K7 融合蛋白表达的最佳条件,诱导成功并得到了高纯度的
融合蛋白,为进一步研究MAP3K7 蛋白的生物学功能奠定了基础。     

化学转化中整装内质网分布与细胞表型相关性研究

首次尝试在培养细胞的化学转化实验中应用整装细胞内质网技术以观察细胞超微结构及分布变化与细胞表型的关系,实验结果证实整装细胞内质网方法可清晰显示转化中细胞的超微结构,分布及相邻细胞器的全貌,并观察到处理组内质网分布变化同期伴有细胞表型改变,表现为高饱和生长密度,接触抑制缺失,细胞多型性等,这种一致性证明内质网与细胞癌变密切相关,整装内质网技术是一项较好而实用的检测早期转化细胞超微结构改变的细胞学方法,该实验为今后探讨转化中细胞超微结构整体变化提供了新的研究手段及模型系统,并从整体的角度丰富了转化细胞超微结构的科学资料。