成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1小鼠的制备

目的 制备在成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1的特定细胞阶段性基因敲除小鼠.方法 从美国NIH引进SPF级fgfr1条件性基因敲除(fgfr1flox/flox)小鼠,进行饲养、繁殖和PCR鉴定;fgfr1flox/flox小鼠与在成熟成骨细胞表达Cre重组酶的OC-Cre小鼠交配,获得在成熟成骨细胞中敲除一个基因拷贝的杂合子小鼠;杂合子小鼠之间交配,或者杂合子小鼠与fgfr1flox/flox小鼠交配,可以获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1基因的小鼠fgfr1△/△/OC-CreTG/ .结果 成功制备在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的细胞特异性敲除小鼠.结论 成功引进fgfr1flox/flox小鼠,应用合理的基因条件性敲除繁殖策略,获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的基因敲除小鼠.     

高效稳定表达人缺氧诱导因子抑制因子肠上皮细胞株的建立

目的通过转染含有人FIH全长cDNA的质粒pcDNA3．1-V5．His-A-FIH，建立FIH高效表达的肠上皮细胞株。方法对pcDNA3．1-V5-His-A-FIH进行扩增、提取，用脂质体Lipofectamine 2000将pcDNA3．1-V5-His-A-FIH转入Caco-2细胞，经G418筛选并逐步传代，RT-PCR和Western blot法检测阳性细胞克隆FIH mRNA和蛋白表达。结果转染pcDNA3．1-V5-His-A-FIH后Caco-2细胞FIH mRNA是普通Caco-2细胞的1．98倍，而FIH蛋白含量是普通Caco-2细胞的1.70倍。结论成功建立了高效、稳定表达人FIH基因的肠上皮细胞株。     

脓毒症模型大鼠循环内皮细胞与肝功能状态间关系的相关性研究

目的 探讨大鼠脓毒症中循环内皮细胞(circulating endothelial cells, CEC)数量的变化及其与肝功能改变的关系.方法 利用盲肠结扎穿孔模型(CLP)在大鼠制作脓毒症模型.观察CEC数量、白细胞数量的变化、以及肝组织病理组织学、血天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的改变.并探讨CEC数量与AST和ALT的相关关系.结果 CLP 6 h后动物肝细胞明显肿胀,24 h组肝细胞大量空泡变性,乃至坏死.CLP 3 h组白细胞和CEC数量比对照组明显升高.而CLP 6 h后AST、ALT才出现明显增高.CEC数量与AST和ALT水平呈负相关,Pearson相关系数(r)分别为-0.774 和-0.734(P＜0.01).用非线性回归分析CEC数量与AST和ALT的关系,发现CEC数量对ALT的最佳拟合曲线为幂函数(P＜0.05),其方程为ALT=33.052 681 24.097 309 CEC -1.CEC数量对AST的最佳拟合曲线为对数函数,但无统计学意义(P=0.607).结论 在大鼠脓毒症模型中,比起常规肝功能指标,CEC数量更能敏感反映肝脏病理进程.当肝功能指标高于正常阈值时肝细胞已经出现了显著损伤.因此,早期监测CEC数量结合已有的肝功能指标有助于早期提示肝功能损害,及时针对治疗.     

严重烧伤大鼠肝脏葡萄糖转运体1蛋白表达的实验研究

目的　探讨严重烧伤大鼠早期肝脏葡萄糖转运体 1(Glucosetransporter 1,GLUT 1)蛋白及其转录活性的变化和意义。方法　采用 3 0 %TBSAⅢ度烧伤大鼠模型 ,以正常大鼠为参照 ,WesternBlot法检测伤后 0 5、1、2、4、8、16h肝脏总蛋白中GLUT 1的表达 ;体外转染含有大鼠GLUT 1全长调控序列的报告基因构建体A ,2 4h后 ,1%氧浓度诱导表达 ,以 β 半乳糖苷酶为参照 ,分析报告基因表达强度的变化。结果　①与正常对照相比 ,严重烧伤后 1h大鼠肝脏Glut 1蛋白表达明显增加 (增加约 1 3 2倍 ) (P <0 0 5 ) ,在伤后 4～ 8h变化最为明显 ,约为正常对照的 2倍 (P <0 0 5 ) ,烧伤后 16h ,GLUT 1蛋白含量降低 (P <0 0 5 ) ;②构建体A转染 2 4h后 ,缺氧处理 3h ,报告基因的表达明显升高 ,增高约 3 19倍 (P <0 0 5 ) ,缺氧6h ,报告基因的表达增强 2 2 3倍 ,与 3h相比无明显差异 (P >0 0 5 )。本试验观察期内 ,缺氧处理 12h报告基因的表达强度最大 ,诱导表达倍数约 5 3 4倍 ,与缺氧 3、6h存在显著差异 (P <0 0 1)。结论　①严重烧伤以后 ,大鼠肝脏的GLUT 1蛋白含量增加。②缺氧诱导了大鼠GLUT 1基因 5′侧翼区全长序列介导的报告基因的表达     

构建FGFR3基因沉默慢病毒载体及其对ATDC5细胞增殖和分化的影响

目的 通过构建慢病毒介导的FGFR3 RNAi,观察FGFR3对小鼠前软骨细胞系ATDC5增殖和分化的影响.方法 针对FGFR3基因的有效靶序构建FGFR3RNAi慢病毒载体,并转染293T细胞进行病毒包装.用包装成功的慢病毒转染ATDC5细胞,Real-time PCR和Western blot检测ATDC5中FGFR3RNAi效率,细胞计数及MTT检测ATDC5的增殖变化,Real-time PCR检测ATDC5中软骨分化相关分子Ⅱ型胶原(collagenⅡ,ColⅡ)、X型胶原(collagen X,Col X)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的表达与变化.结果 FGFR3RNAi慢病毒载体构建成功,并包装出相应的慢病毒,滴度为5×108TU/mL.FGFR3RNAi慢病毒转染ATDC5后FGFR3 mRNA水平分别较空白组和阴性对照(NC)组下降了65.2％和68.8％ (P ＜0.01).Western blot结果显示,与空白组和NC组相比,FGFR3RNAi组FGFR3蛋白水平显著降低(P＜0.01).细胞计数及MTT检测结果显示,FGFR3RNAi组细胞增殖能力较空白组和NC组增强(P ＜0.05,P＜0.01).Real-time PCR 结果显示,经向软骨诱导分化后,FGFR3RNAi组细胞中ColⅡ、Col X和MMP-13的表达水平较空白组和NC组显著增加(P＜0.01).结论 成功包装的FGFR3RNAi慢病毒能有效降低ATDC5细胞中FGFR3基因的表达.FGFR3表达水平降低后对ATDC5细胞增殖和分化的抑制作用明显减弱.     

谷氨酰胺联合泛醇对烧伤家犬肠道损伤的影响及机制研究

目的观察应用谷氨酰胺、泛醇及其复方制剂对减轻烧伤家犬肠道损伤的疗效并探讨其机制。方法采用30%体表面积Ⅲ度烧伤家犬模型,动物随机分为正常对照、烧伤对照、泛醇、谷氨酰胺、泛醇+谷氨酰胺5个组,每组6只家犬,观察伤后7d各组动物肠道损伤和修复指标。结果烧伤家犬乙酰胆碱、肠黏膜蛋白含量明显降低,血浆二胺氯化酶(DAO)含量和损伤指数则明显增高(P<0.05),给予谷氨酰胺、泛醇以及复方药物均可明减轻烧伤后肠道损伤,降低血浆DAO活性和黏膜损伤指数(P<0.05);给予泛醇则能明显增加乙酰胆碱合成。与单方组相比,复方制剂组上述各项指标均明显优于单方组。结论烧伤后肠道损伤明显,给予谷氨酰胺能明显减轻肠道损伤,给予泛醇能明显促进乙酰胆碱合成,促进胃肠运动,复方制剂疗效明显优于单方。     

融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化

目的 构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1α PAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化.方法 分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLyss内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(NiNTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化.结果 成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白.结论 含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础.     

小鼠胚胎瘤来源细胞系ATDC5的体外软骨分化诱导研究

目的 在体外建立稳定有效的软骨细胞分化模型.方法 复苏ATDC5细胞,在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况,细胞90%融合时分别用不含Vc和含Vc的诱导培养基培养进行分化诱导.诱导21 d,阿力新蓝染色,RT-PCR检测Ⅱ、Ⅹ型胶原表达进行鉴定.结果 含50 μg/mL Vc的诱导培养基诱导1 周便可见明显的软骨小结,细胞产生软骨基质明显增多,Ⅱ及Ⅹ型胶原表达明显增高,且Ⅹ型胶原表达呈提前.结论 利用ATDC5细胞系可成功建立软骨细胞分化体外模型.     

维生素D信号通路在骨骼稳态维持中的作用

维生素D作为一种重要的类固醇激素在骨骼发育和稳态维持中发挥重要作用。机体从外界获取的维生素D需在体内经过2次羟化转变为活性1,25-二羟基维生素D3,然后与维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)结合后发挥生物学作用。传统观点认为1,25-二羟基维生素D3在体内主要通过内分泌途径作用于肠道和肾脏,通过调节钙磷吸收和重吸收维持矿物质稳态,并因此间接调节骨骼稳态。近年发现1,25-二羟基维生素D3能直接作用于成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞等,通过调节其增殖、分化直接调节骨形成与骨吸收,维持骨稳态的平衡。     

胰高血糖素样多肽2受体上调表达的Caco2细胞株克隆转染与筛选鉴定

目的建立胰高血糖素样多肽2受体(glucagon like peptide-2 receptor,GLP-2R)上调表达的Caco2细胞株。为研究GLP-2肠道保护机制构建体外模型。方法常规扩增抽提GLP-2R／pcDNA 3．1质粒,经酶切、测序鉴定正确后,用脂质体转染法将其转染至Caco2细胞。G418抗性筛选,挑选耐药细胞克隆培养获得稳定细胞株。以HER293细胞、VE细胞、正常Caco2细胞及正常人小肠组织为对照,采用逆转录聚合酶链反应与蛋白质印迹法检测稳定转染细胞中mRNA及其蛋白的表达。结果扩增抽提GLP-2R／pcDNA 3．1质粒后经酶切、测序结果正确。GLP-2R mRNA及其蛋白在HER293细胞及VE细胞中无表达,在正常Caco2细胞中表达微弱,在人小肠组织中有较强表达;转染CLP-2R后,Caco2／GLP-2R( )细胞中GLP-2R mRNA及其蛋白表达明显增强。结论GLP-2R分布具有相对特异性,正常Caco2细胞中GLP-2R表达较弱;构建的Caco2／GLP-2R( )细胞模型成立,为深入研究GLP-2的作用机制奠定了良好基础。