抗ANXA2单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备ANXA2特异性单克隆抗体(McAb),为研究ANXA2的生物学功能和检测该蛋白提供有力的抗体工具。方法用经IPTG诱导表达的基因重组PGEX-4T-1-ANXA2抗原免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法筛选抗ANXA2杂交瘤细胞,用ELISA法鉴定所得单抗腹水的效价及Western blot鉴定McAb特异性。单抗纯化和Eu3+标记后,分别包被聚苯乙烯板及作为铕标单抗,利用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)筛选出检测ANXA2蛋白的最佳配伍单抗。结果经细胞融合、筛选、克隆化,获得了16株可分泌高效价单抗的杂交瘤细胞,间接ELISA显示16株McAb与空载体PGEX-4T-1均未发生交叉反应,抗体特异性良好,16株抗体腹水效价为1∶8 000~1∶256 000,培养上清效价为1∶256~1∶512,纯化的腹水单抗经配对试验,2D6和9H9-Eu3+配对最佳。结论获得16株能稳定分泌高特异性抗ANXA2的杂交瘤细胞,能用于后续研究。     

稳定过表达、干扰RN181的MHCC97L细胞系建立及RN181功能的初步研究

目的构建过表达和干扰RNl81基因的肝癌MHCC97L重组细胞系，并研究RNl81对该细胞体外增殖的影响。方法基于基因克隆技术，构建plncx2一GFP—IRES／RNl81重组载体，常规鉴定后，与pVSV—G共转染GP2—293细胞包装逆转录病毒。该病毒与RNl81干扰慢病毒分别感染MHCC97L细胞，流式分选表达绿色荧光的细胞，RT—PCR、Westernblotting鉴定后，CCK．8实验和软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖情况。结果重组载体构建成功，重组细胞荧光良好，RT．PCR、Westernblotting分别证实重组细胞中RNl81的mRNA和蛋白表达水平在重组细胞系间均出现差异有统计学意义（P〈0．05）。增殖实验显示RN181上调后细胞生长减慢，克隆数也显著少于对照组（P〈0．05），而RNl81干扰后上述现象可得到逆转。结论成功构建了过表达和干扰RNl81的MHGC97L重组细胞系．初步证实了RNl81在体外对MHCC97L细胞增殖的抑制作用。