利用PCR技术构建GM-CSF/Fc_(γ2)~-融合蛋白真核表达载体

目的　对融合基因GM -CSF Fcγ2 进行定点突变 ,去除其补体结合位点 ,构建GM -CSF Fcγ2-融合蛋白真核表达载体。方法　通过设计突变引物 ,利用PCR定点突变技术扩增融合基因GM -CSF Fcγ2-。并通过T -A克隆策略 ,把突变后的融合基因GM -CSF Fcγ2-重组到真核表达载体pRc CMV2中 ,构建真核表达质粒pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-并经过酶切和测序确证。结果　成功对融合基因GM -CSF Fcγ2-进行了突变 ,构建了真核表达载体pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-。结论　利用该PCR方法进行基因定点突变可行     

利用CHO（dhfr^—）细胞高效表达GM—CSF／Feγ2^—融合蛋白

目的 利用二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO（dhfr-)高效表达融合蛋白GM－CSF／Feγ2^-。方法 利用脂质体基因转染技术,把含有融合基因GM－CSF／Feγ2^-的真核表达质粒pRc/CMV2/GM-CSF/Feγ2^-和含有二氢叶酸还原酶基因的真核表达质粒pSV2-dhfr共转洒二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO（dhfr-)中。用G418和撤除H、T（次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷)双筛选,获得dhfr neo 双表型阳性的细胞克隆。取表达产量最高的克隆进行亚克隆,并行MTX加压筛选,以提高表达量。用RT－PCR、ELISA和Western blot对表达产物进行鉴定并行MTT法检测表达蛋白的生物学活性。结果 成功地表达出了具有GM－CSF生物学活性的融合蛋白GM－CSF／Feγ2^-。结论 该方法可行,表达量达到15μg/ml。     

利用PCR技术构建GM—CSF／Feγ2^—融合蛋白真核表达载体

目的 对融合基因GM－CSF／Feγ2^-进行定点突变,去除其补体结合位点,构建GM－CSF／Feγ2^-融合蛋白真核表达载体。方法 通过设计突变引物,利用PCR定点突变技术扩增融合基因GM－CSF／Feγ2^-。并通过T－A克隆策略,把突变后的融合基因GM－CSF／Feγ2^-重组到真核表达载体pRc/CMV2中,构建真核表达质粒pRc/CMV2/GM－CSF／Feγ2^-并经过酶切和测序确证。结果 成功对融合基因GM－CSF／Feγ2^-进行突变,构建了真核表达载体pRc/CMV2/GM－CSF／Feγ2^-。结论 利用该PCR方法进行基因定点突变可行。     

甲基化CpG岛扩增联合代表性差异分析方法在筛查人非小细胞肺癌组织中高甲基化修饰序列的应用

目的探讨甲基化CpG岛扩增联合代表性差异分析(MCA/RDA)方法在筛查人非小细胞肺癌(NSCLC)组织中高甲基化修饰序列的应用。方法以92对NSCLC和癌旁对照组织DNA为研究对象,应用MCA/RDA方法筛查肺癌组织DNA中高甲基化修饰的CpG岛序列。应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和甲基化特异性PCR(methylation-sensitive PCR,MSP)技术,分析胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-4)基因启动子区CpG岛的甲基化修饰与基因表达的相关性。结果获得5个经Slot Blot验证在肺癌组织中高甲基化修饰的CpG岛序列(IGFBP-4、KLK10、ADAM23、GADD45G和DUOX1)。甲基化抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine处理NSCLC细胞可明显上调IGFBP-4基因的表达。在41例(44.6%)癌组织中检测到IGFBP-4表达水平显著低于癌旁对照组织。47例(51.1%)癌组织检测到IGFBP-4高甲基化显著高于癌旁组织的检出率(16.3%,15/92;P<0.001)。IGFBP-4高甲基化与基因表达呈负相关(r=-0.396,P<0.001)。IGFBP-4高甲基化与TNM分期(P=0.013)和淋巴结转移(P=0.022)相关。结论应用MCA/RDA方法筛查到5个在NSCLC组织中高甲基化修饰的CpG岛序列,并证实IGFBP-4启动子区CpG岛的高甲基化可能通过抑制基因的表达参与了NSCLC的发生。     

利用CHO(dhfr~-)细胞高效表达GM-CSFFc_(γ2)~-融合蛋白

目的　利用二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO(dhfr - )高效表达融合蛋白GM -CSF Fcγ2-。方法　利用脂质体基因转染技术 ,把含有融合基因GM -CSF Fcγ2-的真核表达质粒pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-和含有二氢叶酸还原酶基因的真核表达质粒pSV2 -dhfr共转染二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO(dhfr - )中。用G4 18和撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷 )双筛选 ,获得dhfr +neo +双表型阳性的细胞克隆。取表达产量最高的克隆进行亚克隆 ,并行MTX加压筛选 ,以提高表达量。用RT -PCR、ELISA和Westernblot对表达产物进行鉴定并行MTT法检测表达蛋白的生物学活性。结果　成功地表达出了具有GM -CSF生物学活性的融合蛋白GM -CSF Fcγ2-。结论　该方法可行 ,表达量达到 15μg ml。