PAI-2的两个突变体对TNF-α诱导细胞凋亡的抗性

目的 研究纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)的两种不同突变体抵抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导Hela细胞凋亡的活性差异，探讨PAl-2CD螺旋间区的空间构象对其抗凋亡功能的影响。方法 分别构建突变体PAI-2D和PAI-2M真核表达质粒。转染Hela细胞，RT-PCR鉴定，筛选出能稳定表达PAI-2D和PAI-2M的阳性细胞株。用MTT法检测PAI-2的这两个突变体抗凋亡的活性，并利用计算机同源模建，比较PAI-2的这两个突变体空间构象的变化。结果 突变体PAI-2M能抑制TNF-αa诱导的Hela细胞凋亡，而PAI-2D则不能。PAI-2M较好地保持了野生型PAI-2的空间构象，而PAI-2DCD螺旋间区的空间构象则发生了较大的变化。结论 PAI-2抑制TNF-α诱导的细胞凋亡依赖于其CD螺旋间区空间构象的完整性，而与PENF结构域(PENF73～76)无关。     

HA20-Iys10在大肠埃希菌中的融合表达纯化和凝胶阻滞试验

目的表达和纯化流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合蛋白HA20-Iys10，并观察其与质粒结合的能力。方法用PCR方法构建流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合基因HA20-Iys10，并克隆于pET32a( )原核表达载体。将重组表达质粒pET-HA-K转化大肠埃希菌BL21（DE3)，当A(Abs)600nm达到0．6时，加入终浓度为1mmol／L IPTG诱导目的蛋白的表达。表达产物用亲和层析一步法进行纯化，然后用凝胶阻滞试验观察重组蛋白结合质粒的能力。结果IPTG诱导后可获得相对分子质量约为27000的目的蛋白，表达蛋白以可溶形式存在，占菌体蛋白20％以上。表达菌超声后，表达产物经亲和层析一步纯化后可获得纯度达85％以上目的蛋白。凝胶阻滞试验发现，纯化的重组蛋白在一定条件下可以与质粒结合，使质粒的迁移率明显改变。结论融合蛋白HA20-Iys10有望用于受体介导基因转移，以提高基因转移的效率。     

HA20-lys10在大肠埃希菌中的融合表达纯化和凝胶阻滞试验

目的表达和纯化流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合蛋白HA20-lys10,并观察其与质粒结合的能力.方法用PCR方法构建流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合基因HA20-lys10,并克隆于pET32a(+)原核表达载体.将重组表达质粒pET-HA-K转化大肠埃希菌BL21(DE3),当A(Abs)600nm达到0.6时,加入终浓度为1 mmol/L IPIG诱导目的蛋白的表达.表达产物用亲和层析一步法进行纯化,然后用凝胶阻滞试验观察重组蛋白结合质粒的能力.结果IPTG诱导后可获得相对分子质量约为27 000的目的蛋白,表达蛋白以可溶形式存在,占菌体蛋白20%以上.表达菌超声后,表达产物经亲和层析一步纯化后可获得纯度达85%以上目的蛋白.凝胶阻滞试验发现,纯化的重组蛋白在一定条件下可以与质粒结合,使质粒的迁移率明显改变.结论融合蛋白HA20-lys10有望用于受体介导基因转移,以提高基因转移的效率.     

血清诱导95D细胞中Nm23H1从细胞质转位至细胞膜板状伪足

目的　探索Nm2 3H1(肿瘤转移抑制因子之一)在细胞内的定位与其功能关系。方法　以人肺巨细胞癌95D细胞为模型,在血清饥饿2 4h后加入血清,观察细胞形态变化及Nm2 3H1在细胞内的分布变化。结果　血清刺激可以诱导95D细胞形成板状伪足,细胞免疫荧光实验发现Nm2 3H1主要分布于细胞质,但在血清诱导形成的细胞板状伪足部位出现显著的Nm2 3H1分布。亚细胞组分分离及免疫印迹的实验结果也证实Nm2 3H1在血清刺激下可以转位到细胞膜,并且这种诱导作用是迅速的,在30min左右达到高峰,8h后降至仍然略高于血清诱导前的水平。结论　Nm2 3H1这种特殊的定位可能涉及细胞的运动,为进一步研究Nm2 3H1的功能与作用机制提供了基础。     

PAI-2在细胞内的定位影响其抗凋亡的活性

目的 为了进一步了解纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在细胞内的定位对其抗凋亡活性的影响。方法 构建绿色荧光蛋白质(EGFP)与PAI-2入核突变体融合蛋白质的表达质粒；转染HeLa细胞，荧光显微镜下比较野生型PAI-2与PAI-2的入核突变体在HeLa细胞内分布的差异；用MTT法检测．PAI-2入核突变体抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导细胞凋亡的活性。结果 在核定位序列的引导下，几乎所有的PAI-2都进入了细胞核，而野生型PAI-2则弥散分布于HeLa细胞内。MTT法检测发现，当PAI-2被定位于细胞核内时，丧失其抗凋亡的功能。结论 PAI-2在细胞内的定位能影响其抗凋亡的活性，并且当用TNF-α诱导HeLa细胞凋亡时，野生型PAI-2在细胞内的分布没有发生明显的改变。