人肺癌H1299肿瘤干细胞样细胞的分离培养及鉴定

目的 从人肺癌H1299细胞系中分离培养肺癌干细胞样细胞,并进一步鉴定其干细胞特性.方法 在低黏附条件下无血清诱导培养H1299细胞,富集H1299肿瘤细胞球,利用免疫荧光、流式细胞仪、PCR及Western blot检测干性标志物CD133和ABCG2的表达,并观察克隆形成和体内致瘤能力的改变.结果 肺癌H1299细胞经无血清诱导培养可形成悬浮的细胞球.与普通贴壁H1299细胞相比,细胞球具有更强的增殖能力和致瘤性,且高表达干性基因CD133和ABCG2,差异有统计学意义(P＜0.0S).结论 运用无血清悬浮细胞球培养方法富集的肺癌H1299细胞系肿瘤球高表达CD133和ABCG2,具有干细胞特性.     

康莱特注射液联合紫杉醇对人乳腺癌细胞的化疗增效作用

目的 探讨康莱特注射液(KLT)对紫杉醇(PTX)抑制人乳腺癌细胞增殖及侵袭能力的增效作用及其相关机制.方法 本实验以体外培养的人乳腺癌细胞为研究对象,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、Transwell法检测MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖、侵袭能力,实时荧光定量(qRT)-PCR、Western blot分别检测C-myc、CyclinD1和血管内皮生长因子(VEGF) mRNA和蛋白水平变化.结果 PTX单药能有效抑制人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭能力,降低C-myc、CyclinD1和VEGF mRNA及蛋白的表达,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);KLT呈浓度依赖地增强PTX的作用,与PTX单独用药比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 KLT具有增强PTX抗乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的作用,此作用可能与下调C-myc、CyclinD1和VEGF的表达相关.     

下调miR-210增加放射抗拒鼻咽癌细胞系CNE-2R的放射敏感性

目的研究下调miR-210对鼻咽癌放射抗拒细胞的放射敏感性的影响。方法用剂量梯度法建立鼻咽癌放射抗拒细胞CNE-2R。用microRNA基因芯片检测CNE-2和CNE-2R细胞的miRNAs,用q PCR验证miR-210的相对表达量。用LV-hsa-miR-210-inhibition慢病毒感染CNE-2R细胞,q PCR检测鼻咽癌细胞系210-inhibition中miR-210的相对表达量,用FCM测CNE-2R和210-inhibition细胞的凋亡和周期,用克隆形成实验测CNE-2R和210-inhibition的存活分数。结果诱导成功的CNE-2R与CNE-2细胞比较,有93个表达差异2倍的miRNAs。下调CNE-2R中的miR-210后,与CNE-2R比较,210-inhibition凋亡比例明显增加(P0.05),处于G2/M期的比例明显增加(P0.05),S期的比例明显减少(P0.05),210-inhibition细胞较CNE-2R细胞的存活分数降低。结论下调miR-210可增加鼻咽癌放射抗拒细胞的放射敏感性,其可能作为治疗放射抗拒的新靶点。     

HIF1α特异性人源喉癌噬菌体单链抗体的制备及其对放疗增敏的实验研究

目的 利用噬菌体肽库技术,构建HIF1 α人源喉癌单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),研究其对放疗敏感性的影响.方法 提取喉癌患者癌旁阳性淋巴结总RNA,通过RT-PCR和重叠延伸PCR扩增得到可变区基因scFv,将其重组到载体pCANTAB5E中,转化至TG1大肠杆菌,以制备初级抗体库.以HEP2细胞及HIF1α纯化抗原对抗体库进行淘选.SDS-PAGE电泳检测scFv的可溶性表达,Western blot检测其对HIF1α蛋白表达的影响,ELISA和细胞免疫化学鉴定其特异性,CCK-8检测scFv联合X线照射后HEP2细胞的存活率,克隆形成实验分析scFv处理后HEP2细胞放疗存活曲线.结果 成功制备HIF1α人源喉癌单链抗体scFv,SDS-PAGE电泳证实其可溶性表达且相对分子质量约为34×103,Western blot表明其能下调HIF1α蛋白的表达.ELISA检测到该抗体对HIF1α抗原的识别率高达79％,细胞免疫化学显示该抗体与HEP2细胞特异性结合.CCK-8检测结果显示scFv联合X线照射后,较单纯X线照射组明显降低了HEP2细胞的存活率(P＜0.05),克隆形成实验结果显示scFv对放射的增敏比为1.89.结论 成功构建了HIF1α人源喉癌单链抗体,且其能增加HEP2细胞对放疗的敏感性.     

ABCG2特异性肺腺癌单链抗体的裸鼠体内放免显像及其抑瘤作用

目的 观察ABCG2特异性肺腺癌单链抗体(scFv)在裸鼠体内的放免显像和代谢动力学特征,并探讨其对肿瘤生长的作用.方法 采用不同浓度梯度scFv处理肺腺癌细胞后,Western blot检测ABCG2靶蛋白表达量的变化;CCK-8检测细胞增殖能力改变并绘制生长曲线;流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化;放射性核素131I标记抗体后行裸鼠体内生物分布和SPECT/CT放免显像研究;进一步建立移植瘤模型检测scFv的体内抑瘤能力.结果 scFv干预肺腺癌细胞后导致ABCG2蛋白表达水平较对照组显著降低,并明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞(P＜0.05).裸鼠体内生物分布和放免显像结果显示该scFv具有良好的代谢动力学特征,表现为高效、快速的肿瘤靶部位特异性结合及体内清除能力.结论 肺腺癌ABCG2 scFv具有良好的放免显像效果,并显示出较好的代谢动力学、亲肿瘤和抗肿瘤特性,对肿瘤的生长有抑制作用.