基因步移在分离蚊虫细胞色素P450启动子中的应用及意义

目的：快速扩增出白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因（CYP6N3）上游启动子区序列。方法：根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的5′－末端核苷酸序列,设计2个反向特异引物（GSP1和GSP2）,利用4种限制性内切酶Dra I、EcoRV、PvuⅡ和Stu I分别消化白纹伊蚊溴氰酯抗性株高分子量基因组DNA,消化产物与适配子连接产生4种消化的DNA库（DL1、DL2、DL3及DL40,并分别以此为模板,进行基因步移。用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增,然后再以第1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第2次PCR扩增。结果：第1步PCR结果显示：在上述4种消化文库中分别扩增出约806、2190、2206和3076bp的特异条带;第2步PCR结果与第1次PCR相类似,但各泳道主带扩增效率明显升高。结论：本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3上游启动子区核苷酸序列及其4种限制性内切酶图谱。此外还对基因步移法是在昆虫细胞色素P450多样性及其参与杀虫剂抗性分子机理研究中的意义进行了讨论。     

广州市区致倦库蚊对溴氰菊酯抗药性现状调查

采用浸渍法测定致倦库蚊幼虫的LC50。结果东山区、海珠区、芳村区、荔湾区、越秀区及天河区各采集点致倦库蚊幼虫LC50分别为0.0067ppm、0.0091ppm、0.0072ppm、0.0111ppm、0.0081ppm、0.0130ppm;与致倦库蚊敏感品系相比,对溴氰菊酯抗性比分别为13.1倍、17.8倍、14.1倍、21.8倍、15.9倍、25.5倍。表明广州市区致倦库蚊对溴氰菊酯杀虫剂产生了不同程度的抗药性。     

昆虫CYP6家族与抗药性及其转录调控

已知昆虫细胞色素 P4 50单加氧酶是一类具有多样性的酶 ( Feyereisen,1 999) ,在各种杀虫剂如拟除虫菊酯、有机氯化合物、有机磷化合物及氨基甲酸酯类化合物等的代谢中起重要作用 ( Feyereisen,1 995)。目前已鉴定的昆虫细胞色素 P4 50有 8个家族 ( Scott etal.,1 988) ,但并非每一个家族均与昆虫抗药性有关。通过资料分析显示其中 CYP6家族成员与昆虫抗药性关系密切。有关昆虫 CYP6家族多样性与进化 ,本文作者已另文综述。另外 ,已知细胞色素 P4 50单加氧酶对杀虫剂的代谢抗性是由于基因表达调控尤其是转录调控的改变所致 ( Feyereis…     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因cDNA片段的克隆与鉴定

目的 获得白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因家族中的一个cDNA片段。方法 根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E同源区氨基酸序列,设计1对简并引物,进行反转录PCR,获得一大小与设计的细胞色素P450基因片段相符合的cDNA片段。将该片断与pUC19质粒重组,并克隆至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序;将推导的氨基酸序列进行同源性分析,并用PC/GENE软件绘制系统树。结果 获得了1条长240　bp的核酸序列;所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在36.3%～46.8%之间,但CYP6D1除外,其同源性为29.1%;而与CYP4家族同源性较低,与CYP4C1、CYP4D1、CYP4D2同源性分别为33.3%、32.9%和29.9%;与哺乳动物CYP3A亚家族同源性亦较高;所绘制的系统树显示出与同源性分析相一致的结果。结论 该序列为CYP6家族中某一成员的结构基因片段。     

白纹伊蚊基因组中CYP6家族新成员基因片段的克隆与分析

目的获得白纹伊蚊CYP6基因家族中新成员的基因片段。方法根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E1同源区氨基酸序列,设计1对简并引物,分别以白纹伊蚊敏感品系和抗性品系基因组DNA为模板进行PCR,产物经T-A克隆转化至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序,获得与设计的细胞色素P450基因片段大小相符合的5个基因片段,并将推导的氨基酸序列进行同源性分析。结果在白纹伊蚊敏感品系中获得了2个基因片段(AEDG-S1,AEDG-S2),核苷酸序列长度分别为240bp和236bp;在白纹伊蚊溴氰菊酯抗性品系中获得了3个基因片段(AEDG-R2,AEDG-R3,AEDG-R4),核苷酸序列长度分别为236bp、236bp和239bp。所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在23.1%～53.8%之间,与CYP3家族的同源性在25.6%～43.9%之间,而与CYP4家族同源性较低,为13.9%～24.4%。结论所得5个序列为CYP6家族中5个新成员的基因片段。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因全长cDNA的快速扩增

根据本室已获得的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6家族成员cDNA序列片段，设计一对特异性引物．以上述蚊株总RNA为模板，分别进行5’-cDNA末端快速扩增(5’-RACE)和3’-cDNA末端快速扩增(3’-RACE)，所获得的产物经1．2％琼脂糖凝肢电薄，显示：5’-RACE产物达I.5kb，3’-RACE产物达500bp，扣陈两重叠部分的已知cDNA片段(250bp)，则该CYP6家族成员生长cDNA长度达1．75kb，与其它昆虫中已知的CYP6家旅全长cDNA长度相似；然后再分别切胶回收，并以此(RACE产物)为模板，用上述双引物进行PCR鉴定，结果显示2个RACE产物均包含有已知的250bp cDNA片段，提示所得的RACE产物为该CYP6家族成员生长cDNA。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株基因组中CYP6基因片段的分离与鉴定

目的 获得白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株ＣＹＰ６基因家族中某个成员的一个基因片段。方法 根据家蝇ＣＹＰ６Ａ１、ＣＹＰ６Ｄ１以及致倦库蚊ＣＹＰ６Ｅ１同源区氨基酸序列,设计１对筒并引物,进行ＰＣＲ,获得与设计的细胞色素Ｐ４５０基因片段大小相符合的基因片段。将该片与ＰＵＣ１９质粒重组,并克隆至ＪＭ１０９大肠杆菌中,经筛选后测序;将推导的氨基酸序列进行同源性分析,并用ＰＣ／ＧＥＮＥ软件绘制和系统树。结果 获得了１     

昆虫细胞色素P450异源表达

细胞色素P450酶在昆虫生长、发育及代谢外源化合物上起重要作甩，异源表达是研究昆虫P450酶的结构、功能及其表达调控的重要途径。昆虫细胞色素P450异源表达主要有三大体系：细菌、酵母、杆状病毒表达系统，本就上述三太表达体系在昆虫细胞色素P450研究中的应用作一综述。     

蚊虫细胞色素P450基因系列研究

报告中山医科大学寄生虫学教研室医学昆虫学室近5年来有关蚊虫细胞色素P450基因(CYP450)系列研究结果,包括①通过简并引物PCR分别从致倦库蚊、白纹伊蚊及中华按蚊中获得3个、2个、2个CYP4家族成员基因片段;通过简并引物PCR及RT-PCR从白纹伊蚊中获得16个CYP6家族成员基因片段;②利用cDNA末端快速扩增(RACE)法获得了白纹伊蚊CYP6家族3个新的全长cDNA序列及7个超过其全长一半以上的cDNA序列.GenBankaccessionnumber分别为AF283836-AF283838(全长cDNA序列)和AF284782-AF284783(非全长cDNA序列),被国际P450命名委员会正式命名为CYP6N3v1-v3(全长cDNA序列)和CYP 6N3v4、CYP6N4v1-v6,并证实这些新基因同时存在于白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株及敏感株中;③运用基因步移方法从白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株中扩增出CYP6N3上游3 076 bp调控序列;④对白纹伊蚊CYP 6N3、CYP6N4非翻译区序列功能分析显示昆虫CYP450与其它真核mRNA翻译起始及终止机制相似,但具有多态性的特点;⑤对白纹伊蚊CYP6N3上游启动子区序列特征与功能分析显示蚊虫中CYP450转录起始存在着复杂性;⑥证实蚊虫中CYP6存在多样性,并分析讨论了此种多样性形成的可能机制;⑦分析讨论了蚊虫细胞色素P450 CYP6家族分子进化机制;⑧阐明了下一步研究的目标.     

蚊虫细胞色素P450基因系列研究

报告中山医科大学寄生虫学教研室医学昆虫学室近5年来有关蚊虫细胞色素P450基因（CYP450）系列研究结果,包括：①通过简并引物PCR分别从卷库蚊、白纹伊纹及中华按蚊中获得3个、2个、2个CPY4家族成员基因片段;通过简并引物PCR及RT－PCR从白纹伊蚊中获得16个CYP6家族成员基因片段;②利用cDNA末端快速扩增（RACE）法获得了白纹伊蚊CYP3个新的全长cDNA序列及7个超过其全长一半以上的cDNA序列。GenBank accession number分别为AF283836－AF283838（全长cDNA序列）和AF284782－AF2847830（非全长cDNA序列）,被国际P450命名委员会正式命名为CYP 6N3vl-v3（全长cDNA序列）和CYP 6N3v4、CYP6N4vl-v6,并证实这些新基因同时存在于白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株及敏感株中;③运用基因步移方法从白蚊伊蚊溴氰菊酯抗性株中扩增出CYP6N3上游3076bp调控序列;④对白纹伊蚊CYP6N3、CYP6N4非翻译区序列功能分析显示：昆虫CYP450与其它真核mRNA翻译起始及终止机制相似,但具有多态性的特点;⑤对白纹伊蚊CPY6N3上游启动子区序列特征与功能分析显示：蚊虫中CYP450转录起始存在着复杂性;⑥证实蚊虫中CYP6存在多样性并分析讨论了此种多样性形成的可能机制;⑦分析讨论了蚊虫细胞色素P450 CYP6家族分子进化机制;⑧阐明了下一步研究的目标。