皮肤角质形成细胞的无血清培养方法

目的探索建立少量成年自体皮肤角质形成细胞体外无血清培养体系,为自体组织工程皮肤的构建与移植奠定物质基础。方法:无菌条件下,取2cm×2cm 兔耳皮肤组织块,Dispase 消化,分离真表皮,表皮以胰蛋白酶+EDTA 消化获得角质形成细胞,以含钙和不含钙的角质形成细胞培养液(K-SFM),按不同细胞密度接种于24孔板,观察细胞生长状况;免疫组化鉴定,MTT 法测定不同血清浓度对角质形成细胞增殖分化的影响。结果:在适当的 Ca~(2+)浓度下,少量自体角质形成细胞能够在无血清培养液 k-SFM 中培养扩增,最多可传4～6代。添加血清后可明显加速细胞分化。结论:无血清培养体系适用于少量成年自体角质形成细胞的体外连续培养扩增,培养的细胞可用于自体组织工程皮肤的构建。     

骨髓间充质干细胞联合维生素E对急性肾损伤炎症反应的抑制作用

 目的:探索骨髓间充质干细胞联合维生素E对急性肾损伤中炎症反应的抑制效果,开发针对急性肾损伤的新型治疗模式。方法:采用庆大霉素作为急性肾损伤药物,复制大鼠急性肾损伤模型,以骨髓间充质干细胞联合维生素E对急性肾损伤进行治疗,治疗结束后,收集大鼠的血浆和肾脏组织,采用实时荧光定量PCR及ELISA方法,评价血浆及组织中炎症蛋白的表达。结果:通过骨髓间充质干细胞联合维生素E对大鼠急性肾损伤模型进行治疗后,大鼠血浆中的炎症蛋白显著降低;在肾脏组织中,与单一应用骨髓间充质干细胞或维生素E相比,二者联合在某些炎症蛋白的抑制方面具有更明显的效果。结论: 骨髓间充质干细胞联合维生素E对急性肾损伤中炎症反应具有一定抑制效果,优于单一骨髓间充质干细胞或单一维生素E的治疗方式,所以,这种联合治疗模式在急性肾损伤的治疗方面更具有临床应用价值。     

中药马勃促大鼠成纤维细胞增殖的有效成分

目的通过实验筛选出马勃中促大鼠成纤维细胞增殖的有效成分。方法利用极性不同的溶剂分离提取马勃的主要组分,作用于体外培养的成纤维细胞,观测各组分对成纤维细胞生长的影响,筛选出作用最强的组分,并利用质谱等方法确定有效成分。结果 80%乙醇提取物对成纤维细胞增殖作用明显,并筛选出对成纤维细胞增殖作用较强的有效成分。结论分析得到其有效成分可能为萜类化合物。     

胶原纤维与软骨细胞体外培养的实验研究

目的　研究应用胶原纤维作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性。方法　未经预湿和经预湿处理的胶原纤维支架与人胚关节软骨细胞体外培养 ,采用光镜和电镜观察其亲水性及对细胞吸附力和细胞功能的影响。结果　软骨细胞均匀地分布于胶原纤维支架内 ,经预湿处理后的支架细胞分布更为迅速均匀 ;软骨细胞吸附于支架纤维表面 ,细胞生长代谢旺盛 ,合成分泌细胞外基质。结论　胶原纤维支架具有良好的亲水性 ,有利于软骨细胞的吸附和生长 ,可以作为组织工程技术中细胞培养的支架材料。     

角质形成细胞的培养及其表皮生长因子受体表达

目的:在成功分离人皮肤角质形成细胞的基础上,观察表皮生长因子受体在人皮肤角质形成细胞中的表达情况。方法:实验于2006-3/10在北京大学深圳医院中心实验室进行。采用dispase Ⅱ-trypsin两步消化法获取表皮基底层细胞,用小鼠皮肤成纤维母细胞滋养层和黄素腺嘌呤二核苷酸培养液进行培养。小鼠皮肤成纤维母细胞的预处理:向对数生长期的小鼠皮肤成纤维母细胞培养液中加入丝裂霉素C至终浓度为4mg/L,37℃下培养4h,弃去培养液,用D-Hank’s液洗3次,加入浓度为0.25g/L的胰蛋白酶消化,分离出细胞,离心(200g,5min),用黄素腺嘌呤二核苷酸培养液悬浮细胞,计数,以5.0×104/cm2的密度种于培养皿内,37℃、体积分数0.05的CO2培养箱下培养。角质形成细胞的培养:将分离的角质形成细胞悬浮在黄素腺嘌呤二核苷酸培养液中,以2.0×104/cm2的密度接种在前1天经丝裂霉素C处理的小鼠皮肤成纤维母细胞滋养层上,37℃、体积分数0.05的CO2培养箱下培养。24h换液,以后每3d换1次液。采用免疫细胞化学的方法检测表皮生长因子受体的表达,采用复合逆转录聚合酶链反应检测角质形成细胞中表皮生长因子受体mRNA的表达。结果:采用dispaseⅡ消化法分离了真皮和表皮,获得较多的角质形成细胞,可以避免真皮成纤维细胞的污染。人皮肤角质形成细胞在黄素腺嘌呤二核苷酸培养液中培养5d可见明显的集落,约10d可长满单层。免疫细胞化学显示表皮生长因子受体在细胞表面有明显的表达,复合逆转录聚合酶链反应显示表皮生长因子受体mRNA有明显的表达。结论:用小鼠皮肤成纤维母细胞滋养层和黄素腺嘌呤二核苷酸培养液可以较好地培养原代人皮肤角质形成细胞,表皮生长因子受体在细胞表面有明显的表达,这些结果为与表皮生长因子受体相关的皮肤病(如银屑病)的研究奠定了基础。     

壳多糖基质网架复层组织工程皮肤的动物移植实验

背景：治疗由烧伤或疾病等引起的大面积全层皮肤缺失最为常见的和有效的方法就是皮肤移植修复，但目前面临的最大障碍是皮肤供体不足。以自体皮肤细胞作为种子细胞构建的组织工程皮肤是解决这一矛盾的最理想途径。目的：探讨组织工程皮肤动物移植实验的效果。设计：随机对照实验。单位：一所大学再生医学科学研究所及皮肤科。材料：实验于1998—09／2001—07在吉林大学细胞工程研究室完成。选用新生Wistar大鼠20只；8周龄雄性裸鼠24只。方法：应用以壳多糖为基质网架构建的组织工程化复层人工皮肤，对裸鼠大面积(直径20mm)全层皮肤缺损模型进行移植修复。24只8周龄裸鼠分为组织工程皮肤移植(artificial skin，AS)组、壳多糖膜覆盖物(chitosan，CH)组及对照组(control gmup，CG)，术后进行大体观察，并在3，7，14和21d应用组织学、红外热像扫描分析等手段对修复组织进行动态监测。主要观察指标：①实验动物大体观察情况。②修复区血供情况的红外热像观察。③组织学观察。结果：AS组在移植第3天，移植的组织工程皮肤与自体皮肤能够很好地融合，有少量毛细血管长人移植物，皮肤移植物颜色与自体皮肤颜色接近；随着时间的延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，表皮层清晰可见基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层，角化现象加强，有角化物脱落；真皮层细胞数量增多，网架逐渐降解，分泌的细胞外基质成份增多；第14天，创面基本愈合；修复区皮肤颜色与正常皮肤颜色非常接近，瘢痕很小，无需进行二次植皮。至移植的第14天，CH组结痂未完全脱落，创面未愈合，颜色较AS组深。对照组的结痂脱落，创面大而深。颜色深红。结论：以壳多糖为基质网架构建的组织工程皮肤具有良好的组织相容性，可应用于皮肤缺损的移植修复。     

表皮生长因子受体与肿瘤治疗的研究进展

肿瘤的发生、复发、转移是一个十分复杂的过程,近年来人们逐渐发现基因变异与恶性肿瘤的发生、发展密切相关.原癌基因的激活即基因变异是导致肿瘤发生的原因之一.表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种酪氨酸激酶受体,在细胞周期中起重要作用,与细胞生长、增殖、迁移有关.其编码基因是一种原癌基因,在生理状态下它不表达或只是有限制的表达,处于非激活状态,不具有致癌性.如果编码该受体的基因发生突变,将会导致多余的表皮生长因子受体产生,增强了细胞信号的传导,便容易诱发肿瘤.表皮生长因子受体的过度活化与肿瘤生长和分级(包括增殖、血管发生、浸润和转移)的关键过程有关.目前,以EGFR作为肿瘤靶标的研究比较多.本文就近年来EGFR与肿瘤发生相关性和靶向治疗的研究进展做一简要综述.     

结肠癌细胞源exosomes的分离鉴定及其表面蛋白CD44v6的表达

目的 探索结肠癌colo205细胞系对exosomes的分泌功能,并分析热休克作用对表面蛋白CD44v6表达量的影响.方法 采用超速离心法分离colo205细胞分泌的exosomes和热休克处理后colo205细胞分泌的exosomes(Heat shocked exosomes,HS-Exo),经220 nm微孔滤膜过滤纯化后,在透射电镜下观察其形态,并用SDS-PAGE方法分析细胞与exosomes的蛋白组成,Western Blot检测表面CD44v6的表达情况.结果 经透射电镜观察,正常exosomes与HS-Exo形态基本相似,均为圆形或椭圆形膜性囊泡,直径大多在30～100 nm之间,且经热休克处理的colo205细胞及其分泌的HS-Exo,在CD44v6表达量上较正常colo205细胞及exosomes显著上调(P＜0.05).结论 结肠癌colo205细胞系可分泌exosomes,且超速离心结合滤膜过滤的分离纯化方法切实可行;热休克作用可使CD44v6表达上调,说明HS-Exo较exosomes可能在肿瘤免疫治疗方面有更重要的应用价值.     

细菌纤维素构建组织工程角膜基质的方法及其评价

目的：探讨以细菌纤维素(BC)为支架构建组织工程角膜基质的可行性。方法： 体外分离培养兔和人角膜基质细胞,种植到BC膜中,构建完成后进行兔和人角膜基质细胞-BC复合膜的生物检测,并将兔角膜细胞生物复合物进行同种异体移植。术后1、4和8周时分别活体行前节OCT、角膜共焦显微镜检查,离体后组织学及免疫组织化学检查。结果： 人和兔角膜基质细胞长入BC的网架结构,细胞生长状态良好。移植术后1周兔眼无炎症反应及新生血管,4周后植片边缘出现新生血管,表面无水肿及溃疡形成。术后8周角膜共焦显微镜显示：移植片周围基质细胞增生活跃,邻近的角膜内皮细胞数量和形态正常。前节OCT显示：移植后复合膜逐渐降解,4周时复合膜边界模糊,8周时密度接近正常角膜组织。离体组织学检查显示：BC复合膜与正常角膜基质相似,有炎细胞浸润和血管形成,角膜组织无坏死和溶解。结论： BC无细胞毒性,具有良好的组织相容性和可降解性,可作为构建组织工程角膜基质的生物支架。     

基于问题的研究生药动学课程教改实践探索

"基于问题"的教学方法,以学生为中心,积极开发学生自主学习的潜能,提升研究生的国际化水平和创新能力,是广大教师积极探索实践的教学改革方向。吉林大学药学院在研究生药动学课程教学改革中,实践基于问题的教学方法,包括问题教学、研讨教学、案例教学及点评教学等改革手段,结果学生积极参与教学环节,极大提高了学生的自主学习能力,扩充了药动学课程的学习内容,知识脉络清晰,学生应用知识分析问题和解决问题的能力及表达才能均得到了全面提升,在教学改革中,师生都受益匪浅,取得了满意的教和学的效果。因此,"基于问题"的研究生药动学课程教学改革,是提升研究生综合素质和创新能力的有益教学方法改革尝试,值得在适宜的学科深入探索实践。