银染法和鬼笔环肽染色观察不同发育阶段小鼠骨细胞突触

目的 采用银染法和鬼笔环肽染色方法探究骨细胞突触在不同发育阶段的组织形态并探讨两种染色方法在观察小鼠骨细胞不同发育阶段形态中应用价值。方法 取出生后0 d（P0）、5 d（P5）、15 d（P15）、21 d（P21）、28 d（P28）、35 d（P35）野生型小鼠的肱骨、股骨，制备冰冻切片及石蜡切片。对P35小鼠的股骨切片进行H&E染色，作为观察骨小梁和皮质骨中骨细胞的参照。对其他时期的肱骨组织切片采用银染法染色观察骨细胞和骨小管的形态，并记录各时期小鼠肱骨骨皮质和骨小梁中骨小管的长度。选取P10、P15两个时期小鼠肱骨的冰冻切片进行鬼笔环肽 iFlour-488染色，观察骨细胞的形态，并记录骨皮质中骨细胞突触的长度。结果 通过银染法染色，在P0~P15时期的小鼠肱骨骨小梁中，我们仅能观察到骨细胞轮廓，无法观察到骨小管的形态。在P21后，通过银染法可以观察到骨小梁骨细胞及骨小管的形态，且骨细胞周围骨小管的长度随年龄逐渐变长，P21 vs P28（P<0.05），P21 vs P35（P<0.05），排列整齐。在P15时期的小鼠肱骨骨皮质中，通过银染法即可以观察到骨细胞及骨小管的形态，且骨细胞周围骨小管的长度随年龄逐渐变长，P15 vs P21（P<0.005），P15 vs P28（P<0.0001），P15 vs P35（P<0.0001），排列整齐。采用鬼笔环肽iFlour-488染色，可以观察到P10和P15时期骨细胞的完整形态，骨细胞突触随着年龄增加逐渐变长，P10 vs P15（P<0.01），与周围骨细胞连接。结论 小鼠骨细胞突触随骨骼发育长度逐渐加长、排列逐渐整齐。银染法可以观察成年后骨细胞及骨小管的形态，对生长发育早期的骨小管形态显像不足。鬼笔环肽染色标记细胞骨架的方法适用于生长发育各时期的骨细胞染色，可以实现在发育早期对骨细胞的形态的检测。     

磷酸钙/壳聚糖/小分子腺苷复合材料修复大鼠颅骨极限骨缺损

目的观察新型生物复合材料在SD大鼠颅骨极限骨缺损中的修复效果,为骨组织工程的相关的基础研究提供实验证据。 方法取18 只8 周龄的雄性SD大鼠,制作颅骨缺损直径达8 mm的圆形极限骨缺损模型,并随机分入不同组,观察时间为12 周。分组情况如下：在颅骨缺损中植入单纯使用蒸馏水作为成形剂的8 mm直径的磷酸钙骨修复替代材料（CPC）支架材料 （CPC对照组）;在颅骨缺损中植入使用10%壳聚糖溶液作为成形剂的8 mm直径的CPC支架材料（CPC/CN组）;在颅骨缺损中 植入用10%壳聚糖液体作为成形剂并每个含有300 μg小分子腺苷的8 mm直径的CPC支架材料（CPC/CN/AD组）。对标本进 行X线、CT、苏木素-伊红染色（HE染色）及相关的定量分析。结果X线影像提示各组骨缺损均有不同程度的修复,骨折线逐渐 模糊,CPC/CN/AD组的骨缺损基本修复。CT结果也是如此。HE染色切片3组均未见急慢性炎症细胞,缺损中可见新生骨组 织,新生骨内及周围可见散在的新生血管,新生骨面积百分数提示CPC/CN/AD组新生骨面积百分数显著大于CPC/CN组和 CPC对照组（P<0.05）,新生血管密度定量提示CPC/CN/AD组的新生血管密度均显著大于另外两组（P<0.05）,但CPC/CN组与 CPC对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论磷酸钙/壳聚糖/小分子腺苷复合材料与传统单纯磷酸钙骨修复替代材料相 比具有更好的促成骨作用,是一种相对理想的新型骨再生修复替代材料之一。     

适用于单细胞RNA测序的半月板细胞提取方法的优化

目的 优化半月板细胞提取的方法,缩短细胞提取时间,稳定地获取细胞数量多和细胞活率高的细胞悬液,使获得的细胞悬液悬液适用于单细胞RNA测序。方法 比较细胞悬液的细胞数量及细胞活率评价不同细胞提取方法的有效性,细胞提取方法包括传统半月板细胞提取法（短时间消化和长时间消化）和优化提取法;通过分析单细胞RNA测序数据集评价优化提取法获取的细胞悬液的稳定性;通过比较优化提取法获得的单细胞RNA测序数据集与公开的半月板单细胞RNA测序数据集,分析优化提取法的可靠性。结果 在3次重复实验中,优化提取法获得细胞数量最多的细胞悬液,细胞数量超过105,且细胞活率最高,平均达80%。通过分析单细胞RNA测序数据发现每个样本中80%以上细胞的线粒体基因含量少于20%。CD34+,MCAM+细胞以及COL1A1+胞均存在每个单细胞RNA测序数据集中。在比较基于优化提取法单细胞RNA测序数据集与公开的半月板单细胞RNA测序数据集时发现,优化提取法也能捕获COL3A1+细胞,COL1A1+细胞,MYLK+细胞,BMP2+细胞,CD93+细胞和CDK1+细胞。结论 优化细胞提取方法能稳定地获得适用于10×Genomics平台的单细胞RNA测序技术的单细胞悬液。     

小鼠胫骨不脱钙树脂包埋法的改良与应用

目的改良树脂包埋复数小鼠不脱钙胫骨的方法,提高树脂包埋法的效率及稳定性,探索减少树脂切片脱片的方法。方 法取15只B6小鼠共30胫骨,标记、固定、脱水、渗透后将其包埋于直径4 mm的圆柱型树脂块中,胫骨近端1/4处切断后再对剩 余的3/4胫骨包埋。在包埋时将5个胫骨切面贴于平整树脂板并包埋于同一树脂块中。分别在包埋液制备、切片、染色3个阶段 随机将样本分为对照组及实验组,分别在3个改良组中采用以下方案处理,包括：向包埋液冲入CO2;在切面上涂抹包埋液;在脱 塑水化前以95 ℃加热切片15 min。分析树脂凝固时间、切片脱片率及骨形成、成骨细胞定量指标。结果成功包埋6个树脂块, 每个树脂块内有5个胫骨,胫骨横截面于同一平面上,树脂块凝固完全,适于切片。向包埋液冲入CO2可以缩短树脂块凝固时 间,提高凝固成功率。在切面上涂抹包埋液可以显著降低切片时的脱片率（P<0.05）且不影响骨标记的荧光分析（P>0.05）。在 脱塑前加热切片可以显著降低脱塑水化后的脱片率（P<0.05）,且不影响成骨细胞定量分析（P>0.05）。结论复数小鼠不脱钙胫 骨的树脂包埋改良法有效可行,这可能是一种理想的不脱钙骨组织研究方法。     

便携式导航辅助全膝关节置换术力线校准的Meta分析

目的应用Meta分析的方法评价便携式导航辅助全膝关节置换术(TKA)与常规人工TKA对术后下肢机械轴线和假体力线的影响。 方法检索Cochrane图书馆、PubMed、EMbase、Web of Science、中国期刊全文数据库、维普咨迅数据库及万方数据库等数据库,根据纳入标准(测量了下肢力线的便携式导航辅助和常规初次TKA临床研究)和排除标准(膝关节内外翻畸形大于15°、术侧髋关节异常),收集所有相关的随机对照试验和非随机对照试验,检索截止日期为2018年5月,由两名评价员独立筛查文献、提取资料和方法学质量评估,采用Cochrane协作网提供的软件Rev Man 5.3.0软件进行Meta分析。 结果一共纳入11篇临床文献(4篇随机对照试验,7篇非随机对照试验),分析1 334膝,其中导航组641膝,常规组693膝。Meta分析结果显示：导航组下肢机械轴线偏离±3°离群个数少于常规组,差异有统计学意义[RR ＝0.57,95%CI(0.43,0.76),P<0.05],而冠状面股骨假体力线[RR ＝0.45,95%CI(0.20,1.06),P ＝0.07]、冠状面胫骨假体力线[RR ＝0.67,95%CI(0.41,1.11),P ＝0.12]、矢状面股骨假体力线[RR ＝1.03,95%CI(0.72,1.46),P ＝0.89]、矢状面胫骨假体力线[RR ＝1.13,95%CI(0.62,2.07),P ＝0.69]两组间差异均无统计学意义。 结论便携式导航辅助TKA恢复下肢机械轴线的精准性优于常规人工TKA,但两者在恢复冠状面和矢状面假体植入位置准确性方面无差异;上述结果尚需要更多高质量、大样本及多中心随机试验来进一步验证。