双荧光逆向追踪法研究大鼠视网膜节细胞的中枢投射

目的：观察向上丘投射的大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)在视网膜内的分布、密度及细胞类型上的差异。方法：将 DiI 与荧光金(FG)注射入 SD 大鼠的同侧和(或)对侧上丘,不同时相荧光显微镜下观察两种荧光标记 RGCs 的分布情况。结果：视网膜与视神经内均可见荧光标记；视网膜内标记 RGCs 的数目随时间延长略有增加。DiI 与 FG 的标记效率无明显差异；RGCs 大多数为对侧投射；视网膜颞背侧区域可见双侧投射细胞；视网膜颞腹侧周边区集中存在同侧投射细胞,多数胞体较大；视网膜其它区域可见零星同侧投射细胞。结论：DiI 与 FG 可高效率逆行标记 RGCs 及部分突起；SD 大鼠视网膜内并存着向对侧、双侧及同侧脑区投射的 RGCs,后二者数量较少,分布局限；同侧投射以大胞体细胞为多。     

感光细胞缺失对视网膜节细胞melanopsin表达的影响

目的：研究感光细胞缺失对视网膜节细胞 melanopsin 表达的影响。方法：SD 大鼠腹腔注射60 mg/kg N- 甲基-N-亚硝基脲建立感光细胞变性缺失的动物模型,用免疫荧光方法观察视网膜铺片及切片中 melanopsin 阳性细胞的分布及特征。结果：在药物注射12 h 后动物视网膜感光细胞层开始凋亡,细胞数目随时相减少,13 d 后完全消失。在正视网膜节细胞表达 melanopsin,呈串珠样分布在胞体及突起的胞膜上,其树突穿过节细胞层, 在内网层的两侧分叉形成网状结构。在感光细胞缺失动物模型组,12 h 时,节细胞表达 melanopsin 更广泛；而后突起上的 melanopsin 表达随时减少。28 d 时,melanopsin 的表达主要局限于节细胞的胞体。结论：感光细胞缺失影响节细胞突起 melanopsin 的表达。     

视网膜祖细胞干细胞特性及移植入视网膜后的研究

目的：研究视网膜祖细胞的干细胞特性及移植入视网膜后的存活和迁移。方法：体外培养胎龄18d 大鼠的视网膜细胞,用 RT-PCR、细胞免疫荧光方法鉴定其增殖分化；成年 SD 大鼠腹腔注射 N-甲基-N-亚硝基脲形成视网膜感光细胞退化的动物模型,培养的视网膜祖细胞用 CM-Di(?) 标记后,移植入模型鼠的玻璃体腔。结果：视网膜祖细胞体外表达中间神经丝蛋白 nestin；表达 Flk-1、Pax6及 Notchl 的 mRNA；能掺入 BrdU；分化后表达视网膜各类细胞特异性蛋白；移植后在实验组大鼠视网膜能存活及迁移,而在对照组中仅聚集在玻璃体腔。结论：视网膜祖细胞具有干细胞特性,移植入受损伤视网膜后,能存活、整合及迁移。     

视网膜细胞培养上清液对骨髓基质细胞的诱导分化作用

目的探讨视网膜细胞培养上清液对骨髓基质细胞(BMSCs)的诱导分化作用。方法原代培养胚龄17d(E17)及生后3d(P3)SD大鼠的视网膜细胞,分别收集培养上清液,过滤后与DMEM按2:3混合,用此混合液诱导BMSCs,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,对诱导后的细胞进行神经丝蛋白(NF)、胶质源性纤维酸性蛋白(GFAP)及视网膜特异性标记物进行免疫化学染色,统计分析阳性细胞数;再用RT-PCR进一步检测诱导结果。结果E17和P3细胞上清液均能诱导BMSCs表达NF[(10.35±2.66)%,(10.64±3.94)%]和GFAP[(27.86±7.97)%,(24.38±5.80)%],但只有P3细胞上清液诱导的BMSCs表达视蛋白(opsin),同时RT-PCR也检测到视细胞发育调节转录因子Crx mRNA的表达。结论视网膜细胞培养上清液可以诱导BMSCs向神经元、胶质细胞与视细胞分化。     

阻断神经生长因子信号部分抑制雌二醇对恒河猴视网膜血管内皮细胞的作用

目的研究神经生长因子(NGF)信号系统在雌激素调控视网膜血管内皮细胞中的作用。方法选用恒河猴视网膜-脉络膜血管内皮细胞系RF/6A，RT-PCR检测雌激素受体(estrogen receptor，ER)、NGF及其受体在视网膜血管内皮细胞中的表达。分别观察雌二醇(estradiol，E2)、NGF及VEGF、EGF、BDNF等对血管内皮细胞活力(MTT法)的作用。用流式细胞术-细胞周期法检测E2、NCF及E2与K252a共同处理组的凋亡率。NGF抗体和选择性TrkA拮抗剂K252a研究对上述作用的阻断效应。同样的分组进行细胞划痕修复实验。96孔板AngioMatrix胶上观察E2及NGF对RF／6A内皮细胞管腔形成能力的影响。结果RF／6A在细胞外基质胶上可形成管腔样结构。RT-PCR检测到ER-α、NGF及NGF受体TrkA的mRNA。1nmol/L～100nmol/L E2可以剂量依赖性的增强细胞活力及单层细胞的划痕修复能力，其增强作用可部分被NGF抗体及100nmol/L的K252a选择性阻断。凋亡率检测显示各组凋亡率相近。E2可促进RF／6A形成管腔，但不能被NGF抗体、TrkA阻断。结论除VEGF外，E2还可通过NGF信号系统对视网膜血管内皮细胞活力、划痕修复起促进作用。但结果提示，阻断NGF信号系统不影响E2促RF/6A形成管腔的作用。     

非神经组织肿瘤中神经元特异性烯醇酶的表达

取54例经手术切除的肿瘤组织标本,用HRP-SPA法作神经元特异性烯醇酶(NSE)免疫组织化学染色。结果表明:在37例各种癌组织切片中,32例NSE染色阳性;在17例各种肉瘤组织切片中,3例NSE染色阳性。两者经x~2检验P<0.001,有极显著差异。NSE在正常情况下主要分布于神经元、神经内分泌细胞及APUD系统的细胞。在肿瘤情况下,除神经元、神经内分泌与APUD系统肿瘤的NSE染色为阳性外,非神经组织来源的肿瘤阳性率较高的有:肺、胃腺癌;肺、食道鳞癌;乳腺浸润性导管癌;肝细胞癌等。可供诊断与鉴别诊断的参考。提示:在肿瘤组织中NSE已失去其在正常情况下的分布特异性。     

氧环境对血管内皮生长因子、色素上皮衍生因子的影响及其与血管发育的关系

目的：研究视网膜发育过程中血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)所起的调节作用及其机制。方法：C57BL/6J 小鼠从出生后7～12 d 饲养于75%氧环境,分别用抗 VEGF、抗 PEDF 和抗 CD31抗体作免疫组织化学标记视网膜切片。结果：持续处于高氧环境时,VEGF 表达处于低水平而 PEDF 快速上升,血管生长减缓。高氧处理5 d 后回到普通环境,VEGF 的表达迅速上升而 PEDF 却逐渐减少,出现了一过性的血管快速增长现象。结论：氧含量变化可调节 VEGF 和 PEDF 表达,参与视网膜血管发育。     

纤溶酶原激活剂及其相关分子在小鼠视神经损伤再生中的变化

目的:检测细胞外基质(ECM)中各蛋白酶在视神经损伤后的变化,分析ECM蛋白酶活性的变化与小鼠视神经损伤和损伤后再生之间的关系。方法:本实验采用建立小鼠视神经钳夹伤的动物模型,用WesternBlot方法检测小鼠视神经损伤后不同时间点神经丝(NF)、金属基质蛋白酶-9(MMP-9)、IgG的表达变化。同时采用原位酶谱分析法检测纤溶酶原激活剂(PA)活性在视神经损伤后各阶段的变化,并分析这种变化与纤维蛋白(原)沉积、髓鞘碎片清除等影响神经再生的因素之间的关系。结果:小鼠视神经损伤后发生进行性Wallerian变性,血-神经屏障(BNB)修复迟缓,沉积的纤维蛋白(原)于损伤后第2d清除。MMP-9在损伤后2d达到高峰,以后仍呈现高水平的表达,且均以前体形式出现。PA活性在损伤后第7d达到高峰,并持续至第28d。结论:视神经损伤后,损伤部位BNB重建、PA激活、纤维蛋白(原)的清除以及MMP-9的表达与周围神经截然不同,正是由于微环境的迥然差异,导致了中枢神经系统(CNS)髓鞘碎片清除不利、轴突再生障碍。     

人眼结膜杯状细胞的定量研究

目的：研究杯状细胞在结膜各个方位的分布、形态及数量。方法：6眼（30－90岁）结膜,采用切片结合铺片的方法,1％阿利新兰,0．3％甲苯胺兰,HE染色,经显微摄像头输入Macintosh图象处理系统计数。结果：杯状细胞呈多房空泡状,圆形,核偏 位,单个,散在或密集分布。不同年龄组均以鼻下象限数量最多。80－90岁组杯状细胞的绝对数明显下降。结论：切片,铺片联合图象处理系统可以定量,准确地计算杯状细胞在结膜中的绝对数,从而为眼表疾病的研究提供有力的参考指标。     

新生小鼠眼睑体外培养的形态学研究

目的通过体外器官型培养法,研究小鼠眼睑体外生长发育的特点。方法实验用自然开睑前不同年龄的新生C57BL/6 J小鼠,切取彼此融合的上、下眼睑,在琼脂小岛上做器官型培养,动态观察眼睑的外形变化和组织切片H-E染色观察。结果新生小鼠上、下眼睑经过15天的培养均未发生分离,睑裂沟处的细胞凋亡过程未表现出在体情况下的有序性。结论眼睑的分离和细胞的凋亡依赖于整体的神经体液调节,而眼睑局部的细胞无法独立有序地完成整个分离过程。