急性髓系白血病干细胞NOD/SCID小鼠白血病模型的建立

目的探讨用非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠和经流式细胞仪分选出的KG1a中CD34＋CD38-的干细胞亚群建立白血病干细胞（LSCs）动物模型,为靶向治疗LSCs的药物筛选奠定体内实验基础。方法 18只雌性NOD/SCID小鼠,体质量18～20 g,鼠龄6～8周龄。实验组12只,应用流式细胞仪分选KG1a细胞中具有LSCs特性的CD34＋CD38-亚群,以2×106个/只尾静脉注射经全身X射线照射2Gy的NOD/SCID小鼠;正常对照组6只,只注射磷酸盐缓冲溶液。观察两组小鼠的一般情况和白血病发生情况,应用形态学、组织病理检查、流式细胞术、骨髓染色体检查等检测实验组小鼠的外周血、骨髓、肝脏、脾脏的白血病细胞标志。结果接种2周后实验组小鼠外周血可见白血病细胞,接种30 d实验组小鼠的白血病发病率为100%,无自发缓解;外周血、骨髓、肝、脾中均可发现大量的白血病细胞浸润;实验组小鼠骨髓细胞中CD13抗原阳性率15.47%～23.66%,并可见KG1a细胞的核型特征。结论尾静脉接种流式细胞仪分选后的CD34＋CD38-KG1a细胞于全身亚致死量X射线照射后的NOD/SCID小鼠,能成功建成全身播散的白血病模型,为进一步研究LSCs的靶向治疗药物奠定实验基础。     

多重实时荧光定量PCR同时检测急性白血病患者WT1和MDR1基因表达水平方法的建立

目的 构建可同时检测AL患者WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR方法.方法 提取K562细胞的总RNA,并逆转录扩增WT1和MDR1的cDNA,通过Bam H Ⅰ及BglⅡ酶切后连接成WT1和MDR1重组片段,对WT1和MDR1重组片段进行PCR扩增,PCR产物纯化后与pMD18载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,构建载有WT1和MDR1基因的标准品重组质粒,用限制性核酸内切酶法和PCR法鉴定质粒.用FAM荧光标记MDR1探针、VIC荧光标记WT1探针,建立能在1个试管中同时检测WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR反应体系.应用该体系检测47例AL患者及32例对照者WT1和MDR1基因表达水平,比较两组之间WT1和MDR1基因表达水平的差异,并随访7例AL患者不同病程中WT1和MDR1基因表达水平的变化与临床预后的关系.结果 经EcoR1酶切及PCR法证实WT1和MDR1基因重组质粒已成功构建.所建立多重实时荧光定量PCR方法的灵敏度为102拷贝/μl;所建立标准曲线的R2分别为0.999和0.998.AL患者WT1和MDR1基因的表达水平中位数分别为37 000(163～6 370 000)拷贝/μg RNA和76 200(179～18 000 000)拷贝/μg RNA,显著高于对照组的258(0～643)拷贝/μg RNA和333(0～779)拷贝/μg RNA,差异有统计学意义(Z=6.755、6.736,P＜0.01).对应用相同的诱导和巩固化疗方案治疗的7例AL患者进行随访,3例持续缓解患者中,WT1和MDR1的表达水平在初治时分别为2 170和86 900、1 130和5 860、1 170和586拷贝/μg RNA,治疗后WT1和MDR1的表达水平明显下降,分别为370和560、138和980、150和690拷贝/μg RNA,此3例患者获长期完全缓解.在3例完全缓解后复发患者中,WT1和MDR1表达水平在初治时分别为1 600和11800、24 800和968、48 200和1 100 000拷贝/μg RNA,在化疗获得完全缓解后均降低,但在随后治疗过程中,WT1、MDR1表达量又逐渐升高,分别为20 314和25 660、184 364和31 530、15 680和878 000拷贝/μg RNA,此3例患者最终均出现临床复发.另外1例未缓解患者初治时WT1和MDR1表达水平分别为81 600和1 200 000拷贝/μg RNA,化疗后WT1、MDR1表达水平不仅未下降,反而有所上升,分别为124 100和7 632 400拷贝/μg RNA,此例患者始终未获缓解.结论 本研究成功构建了可同时检测WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR方法.同时检测AL患者WT1和MDR1基因表达水平的变化可能有助于判断预后.

Abstract：

Objective To set up a multiplex real time quantitative PCR method to detect the expression of WT1 and MDR1 gene simultaneously in acute leukemia patient. Methods Total RNA was extracted from k562 cell line and was reverse transcribed to cDNA by the outer primers of WT1 and MDR1 respectively. The cDNA of WT1 and MDR1 were purified and digested by Bam H Ⅰ and Bgl Ⅱ , and then the two fragments were ligated to form the recombinant fragment WT1 + MDR1. The outer forward primer of WT1 and outer reverse primer of MDR1 were used to amplify the recombinant fragment WT1 + MDR1. The PCR product was purified and cloned into pMD18-T vector, and then transferred into E. coli DH-5α. A new kind of WT1-MDRl-contained standard plasmid was obtained from the positive colony. The recombinant plasmid was verified by digestion with restriction enzyme and PCR amplification. A multiplex real time quantitative PCR method was set up with FAM-labeled MDR1 probe and VIC-labeled WT1 probe in one reaction tube. The WT1 and MDR1 gene expression was detected in forty-seven AL patients and thirty-two controls by this method. Seven patients were followed-up to elucidate the relationship between the gene expression levels and clinical prognosis. Results The recombinant plasmid was confirmed by EcoR1 digestion and PCR amplification. The multiplex real time quantitative PCR technique could reach the sensitivity of WT1 and MDR1 gene up to 102 copy/μl. The standard curve slopes were 0. 999 and 0. 998. The WT1 [ 37 000( 163-6 370 000 )copies/μg RNA ] and MDR1 [ 76 200( 179-18 000 000 )copies/μg RNA ]expression levels of AL patients were significantly higher as compared to the controls [ 258( 0-643 ) copies/μg RNA and 333( 0-779 )copies/μg RNA ]( Z= 6. 755,6. 736, P ＜ 0. 01 ). Following up seven patients with similar regimen of chemotherapy, the WT1 and MDR1 expression correlated to the clinical course. Three AL patients with WT1 and MDR1 expression levels (2 170 and 86 900, 1 130 and 5 860, 1 170 and 586 copies/μg RNA )significantly decreased after chemotherapy and kept in the low range ( 370 and 560,138 and 980, 150 and 690 copies/μg RNA ), and had a favorable outcome. Three AL patients with WT1 and MDR1 expression levels ( 1 600 and 11 800, 24 800 and 968, 48 200 and 1 100 000 copies/μg RNA )decreased after initial chemotherapy, but increased significantly afterwards (20 314 and 25 660,184 364 and 31 530, 15 680 and 878 000 copies/μg RNA ),and suffered clinical relapse. One patient with high WT1 and MDR1 expression levels ( from 81 600 and 1 200 000 copies/μg RNA to 124 100 and 7 632 400 copies/μg RNA )showed the persistence of disease. Conclusions A multiplex real time quantitative PCR method to detect WT1 and MDR1 gene simultaneously is constructed successfully. The expression of WT1 and MDR1 may provide useful information for AL patients prognosis.     

急性淋巴细胞白血病患者BAALC基因表达水平也许有临床意义

目的研究急性淋巴细胞白血病（ALL）患者脑和急性白血病细胞胞浆（BAALC）基因的表达水平及其临床意义。方法57例经细胞形态学、组织化学染色及流式细胞术免疫学分型确诊的ALL患者,其中男性35例,女性22例;中位年龄23（14～66）岁。FAB分型L19例。L245例,L33例。建立实时荧光定量PCR检测BAALC基因表达的技术,并定量检测57例初发ALL患者BAALC基因的表达水平及进一步分析其与临床疗效的关系。结果57例初发ALL患者BAALC基因表达水平显著高于对照组。FAB各亚型中BAALC基因表达水平差异无统计学意义（P〉0．05）,BAALC基因表达水平的高低与初发AI上患者的免疫表型具有显著性相关．T—ALL患者和伴有髓系抗原表达ALL患者BAALC基因表达水平显著高于B—ALL（P〈0．05）和不伴有髓系抗原表达ALL患者（P〈0．01）。ALL中BAALC基因表达的水平与外周血白细胞计数（WBC）、血红蛋白（Hb）、血小板计数（Plt）及骨髓白血病细胞比例无明显相关性（P〉0．05）。BAALC基因高表达ALL患者的完全缓解率（73．3％）同低表达组f81．0％）比较差异无统计学意义（P〉0．05）,但BAALC基因高表达患者1年复发率（81．8％）明显高于低表达组（44．1％）（P〈0．05）。结论BAALC基因高表达提示可能是ALL患者一个不良预后因素,检测ALL患者BAALC基因表达水平可能有助于指导治疗。     

PET／CT显像在急性白血病并发慢性播散性念珠菌病诊治中的应用

慢性播散性念珠菌病（CDC）常见于急性自血病（AL）化疗后合并中性粒细胞减少症的患者,多累及肝和脾,也会累及肺、肾和其他器官,是AL患者常见死亡原因之一。CDC的诊断较困难,且其抗真菌治疗通常需要几个月的时间,如何判断CDC的疗效、指导临床用药及决定停止抗真菌治疗时机十分重要。笔者回顾性分析本院3例AL并发CDC患者PET／CT检查结果,探讨PET／CT在指导AL并发CDC诊治中的价值,现报道如下。     

第54届美国血液学会年会急性淋巴细胞白血病研究领域的主要进展报道

 急性淋巴细胞白血病（ALL）是一组异质性疾病,其预后与患者年龄、免疫亚型、基因和分子生物学特征密切相关。第54届美国血液学会（ASH）年会大量报道了有关ALL发病机制、预后及治疗等领域的最新进展。对ALL的基因表达谱、靶向治疗及造血干细胞移植等方面的亮点进行介绍。     

初治急性髓系白血病患者Bcl11a基因表达水平及其与预后的关系

目的 探讨急性髓系白血病（AML）患者Bcl11a基因表达水平及其临床意义.方法 通过实时荧光定量PCR方法检测80例初治AML患者及16例对照组Bcl11a基因的表达水平,分析其表达水平与疾病特征及临床疗效之间的关系.结果 初治AML患者Bcl11a表达水平高于对照组[0.039（0～ 0.504）比0.014（0.002 ～ 0.086）,P=0.004].以80例初治AML患者Bcl11a基因表达量的中位数作为分界点,将患者分为Bcl11a高表达组和低表达组各40例.Bcl11a低表达组AML患者中位年龄低于高表达组患者（29.5岁比41.0岁）,而初治AML患者在不同分层的性别、FAB分型、外周血象、骨髓原始细胞比例、遗传学危险度分层、免疫分型CD34表达间Bcl11a基因表达水平差异均无统计学意义（均P＞0.05）.Bcl11a基因低表达组患者完全缓解率高于高表达组[90％（36/40）比53％（21/40）,P=0.000],中位生存时间延长（268.0d比101.5 d,P=0.042）.结论 Bcl11a基因表达水平和AML患者年龄、疗效和预后存在一定的关系,Bcl11a基因高表达的AML患者预后较差.     

实时定量PCR检测成人ALL患者ZAP70基因的表达及意义

目的 探讨成人急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中Zeta链相关蛋白-70 (ZAP70)基因的表达及其意义。 方法 构建实时荧光定量检测ZAP70基因表达的PCR技术,定量检测73例初治成人ALL患者ZAP70基因的表达水平。结果 建立的实时定量PCR 方法的标准曲线相关系数r>0.998。51例(69.8%)初治ALL患者可检出ZAP70基因表达。FAB各亚型中ZAP70基因表达水平差异无统计学意义(P>0.05),ZAP70基因表达水平的高低与初治ALL患者的免疫表型差异有统计学意义,T-ALL患者ZAP70基因表达水平显著高于B-ALL 和T、B双表型ALL(P<0.01)。ZAP70基因表达水平的高低与ALL发病时外周血白细胞计数、血红蛋白浓度、血小板计数及骨髓白血病细胞比例无相关关系(P均>0.05)。初治ALL中ZAP70基因高低表达与患者化疗的完全缓解(CR)率差异无统计学意义,但在普通B-ALL组中,ZAP70高表达组的CR率(52.6%)显著低于ZAP70低表达组(85%) (P＝ 0.041)。初治ALL中ZAP70基因高表达患者复发率明显高于低表达组(P＝0.048)。结论 ZAP70基因高表达可能是ALL一个重要的预后不良因素。     

急性髓系白血病MDR1和BAALC基因表达水平及其预后意义的探讨

目的:探讨联合检测初治急性髓系白血病(AML)组织多药耐药基因1(MDR1)及脑和急性白血病胞质(BAALC)的表达量以及在预后判断中的作用。方法:荧光定量PCR检测并分析160例初治AML组织MDR1和BAALC基因的表达量及其与临床疗效和预后的关系。结果:初治AML组织MDR1和BAALC基因表达水平呈正相关性,P<0.001。MDR1高表达的AML患者同低表达组相比完全缓解(CR)率低,复发率高,总生存率低,P值均<0.05;而BAALC高低表达的差异均无统计学意义。MDR1和BAALC均低表达组疗效及预后最好,均高表达组最差。MDR1和BAALC均低表达组和MDR1低表达且BAALC高表达组的CR率均显著高于均高表达组,P值分别为0.004和0.034;前2组复发率(21.6%和25.9%)也显著低于后者(56.0%),P值分别为0.006和0.029;而均低表达组总生存率(62.2%)也显著高于均高表达组(28.3%)和MDR1高表达且BAALC低表达组(38.2%),P值分别为0.002和0.048。结论:MDR1高表达对初治AML患者的预后意义高于BAALC基因,只要检测到MDR1基因的高表达,...     

PET/CT显像在急性白血病并发慢性播散性念珠菌病诊治中的应用

慢性播散性念珠菌病(CDC)常见于急性白血病(AL)化疗后合并中性粒细胞减少症的患者,多累及肝和脾,也会累及肺、肾和其他器官,是AL患者常见死亡原因之一[1].     

双硫仑联合Cu对淋巴瘤Raji细胞增殖与凋亡影响及其机制的探讨

目的:研究双硫仑(Disulfiram,DS)联合Cu离子对Burkitt’s淋巴瘤细胞株(Raji细胞)增殖和凋亡的影响及其与JNK和NF-κB通路的关系。方法:不同浓度DS和DS/CuMTT法检测对Raji细胞的增殖抑制作用;AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测不同浓度DS和DS/Cu作用Raji细胞后凋亡细胞比例;蛋白质印迹法检测Cu、DS及DS/Cu处理细胞后p65、p-JNK及c-jun蛋白表达的变化。结果:DS和DS/Cu对Raji细胞均具有抑制增殖作用,作用72h两组IC50值分别为(0.793±0.08)和(0.085±0.015)μmol/mL,DS/Cu对Raji细胞增殖抑制作用显著强于DS单药,P=0.000。DS单药及DS/Cu对Raji细胞均有诱导凋亡作用,但DS/Cu诱导Raji细胞凋亡比例显著高于DS单药,P=0.001。蛋白质印迹法显示DS及DS/Cu作用Raji细胞后p-JNK及c-jun蛋白表达水平均显著增加、p65蛋白表达水平显著下调。结论:DS/Cu及DS对Raji细胞均有抑制增殖及诱导凋亡作用,其中DS/Cu的作用显著强于DS单药,其机制与同时抑制NF-κB和活化JNK通路有关。