重症急性胰腺炎肝损伤中Toll样受体4与外周血调节性T细胞的关系

重症急性胰腺炎(SAP)的发病机制十分复杂,免疫调节参与病程始末及因免疫紊乱所致复杂多变的临床表现是难以争辩的事实[1].Toll样受体4(TLR4)作为一种重要的脂多糖(LPS)跨膜信号转导受体[2-3],参与内毒素诱发的炎性反应过程,在感染所致炎性反应信号转导中作用重要,作为被最早发现且研究最多的TLR亚型之一[4],其信号传导通路也最明确.调节性T细胞(Treg)是近年来发现的一类具有独特免疫抑制功能的T细胞亚型,常态下其上有少量TLR4表达[5];感染状态下,Treg最主要的功能是调节在机体对抗病原体时T细胞的反应平衡.本实验旨在探讨SAP肝损伤中大鼠肝脏TLR4和Treg可能的作用及免疫学机制,并分析它们的相互关系,为SAP所致肝损伤的发病机制和治疗提供实验依据.     

肠源性内毒素与Treg在重症急性胰腺炎肝损伤中的作用

目的 探讨肠源性内毒素(ET)及CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)在重症急性胰腺炎(SAP)肝损伤中的作用.方法 雄性Wistar大鼠60只,随机分成假手术组(SO组)和SAP组.逆行性胰胆管注射牛磺胆酸钠造模.分别于术后3、6、12 h留取标本,检测血淀粉酶及丙氨酸转氨酶水平,鲎试剂法测血浆内毒素含量,流式细胞术测外周血Treg百分数,肝脏及胰腺行病理组织学观察,免疫组化法测肝脏组织Foxp3表达,并对以上指标进行相关性分析.结果 病理组织学观察及丙氨酸转氨酶水平证实,SAP组肝脏出现病理性形态改变.与SO组相比,SAP各组Treg百分数显著升高(SAP组3、6、12h分别为:2.26％±0.32％、2.36％±0.48％、2.80％±0.35％),差异有统计学意义(P＜0.01).SAP各组ET水平与SO组相比,差异有统计学意义(P＜0.01),与12 h(0.85±0.11)相比,3 h(0.74±0.11)和6 h(0.78±0.07)差异无统计学意义(P＞0.05).SAP各组肝脏Foxp3蛋白表达明显上调,Treg的表达与ET呈正相关(r=0.89,P＜0.01).结论 SAP可致肝损伤,ET与Treg细胞在SAP肝损伤中可能发挥重要作用.     

连翘对重症急性胰腺炎大鼠肝组织中NF-κB和Foxp3表达的影响

目的探讨核因子NF-κB和Foxp3在重症急性胰腺炎（SAP）肝损伤中的作用及连翘对其表达活性的影响。方法雄性Wistar大鼠80只,随机分成假手术组（SO组）、SAP组和干预组,其中干预组分连翘高、中、低剂量组和阳性对照组（PDTC）。牛磺胆酸钠溶液在胰胆管远端注射造模,SO和SAP组于术后3、6、12 h,干预组于术后12 h处死大鼠,分别留取标本。测各组血淀粉酶（AMY）、ALT及TNFα水平,鲎试剂法测血浆内毒素水平,流式细胞术测外周血Treg百分数,对胰腺及肝脏进行病理学检查及评分,RT-PCR法检测肝脏组织中NF-κBmRNA和Foxp3mRNA表达量。组间比较采用单因素方差分析,进一步进行多重比较,采用LSD法进行统计学处理,各指标间相关性分析采用直线相关分析。结果与SO组比较,SAP组中各项指标均随时间升高,于12 h达高峰。与SAP12 h组相比,干预组（大鼠死亡率为0）肝脏组织中的NF-κBmRNA和Foxp3mRNA表达明显降低（P〈0.01）,与Treg呈正相关（r=0.738,P〈0.01）。随连翘剂量增加,AMY、ALT及TNFα水平均明显降低,肝脏和胰腺组织炎症明显减轻,高剂量组和阳性对照组相比较无明显差异（P〉0.05）。结论 NF-κB的激活参与SAP肝损伤的发生,连翘能显著降低NF-κB的活性及肝脏组织中NF-κBmRNA和Foxp3mRNA的表达,减轻SAP肝损伤的严重程度。     

内毒素作用下淋巴细胞中CD4＋CD25＋调节性T细胞变化及连翘对其的影响

目的探讨不同时间点内毒素（LPS）对CD4＋CD25＋调节性T细胞（CD4＋CD25＋regulatory T cell,Treg）的影响及连翘（forsythia suspensa,FS）干预后CD4＋CD25＋调节性T细胞的变化。方法体外培养Wistar大鼠脾脏淋巴细胞,分为对照组、LPS（10ng/ml）组、LPS（10ng/ml）＋多黏菌素B组（10ng/ml）、LPS（10ng/ml）＋连翘（12．5、25、50mg／ml）组,分别于3、6、12h收集标本．流式细胞术检测CD4＋CD25＋调节性T细胞在淋巴细胞中的百分比,荧光定量RT—PCR法检测Foxp3mRNA表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测TNF—a、IL-10分泌水平。结果脾脏淋巴细胞中CD4＋CD25＋Treg的百分比和Foxp3mRNA的表达在12h较3、6h明显升高（P〈0．01）;TNF—a、IL-10的分泌随时间点的延长均显著升高（P〈0．01）;随连翘剂量增加,TNF-a、IL-10分泌水平,Foxp3mRNA表达和CD4＋CD25＋Treg百分比均明显降低（P〈0．05）。结论内毒素参与并诱导了CD4＋CD25＋Treg在淋巴细胞中的变化,其随内毒素作用时间延长呈上升趋势。连翘能显著降低CD4＋CD25＋Treg在淋巴细胞中的百分比。     

重症急性胰腺炎大鼠Treg及内毒素的变化

目的探讨CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)及肠源性内毒素(ET)在重症急性胰腺炎中的作用。方法 60只SD大鼠随机分成假手术组(SO)和SAP组,成功造模后3、6、12h取大鼠胰腺行病理学检查;流式细胞术检测外周血Treg水平;鲎试剂法测血浆内毒素水平。结果 SAP组胰腺病理学评分随病程进展升高,血浆ET,外周血Treg水平逐渐明显升高(P<0.05)。结论 Treg和ET在重症急性胰腺炎发生发展中可能发挥重要作用。     

连翘对内毒素作用下大鼠脾脏淋巴细胞Toll样受体4、核因子-κB及白细胞介素-6、白细胞介素-10的影响

目的 观察连翘对内毒素(ET)作用下大鼠脾脏淋巴细胞Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB (NF-κB)、白细胞介素(IL)-6及IL-10的影响,探讨其抗炎及免疫调节的作用.方法 无菌操作分离大鼠脾脏,制备脾脏淋巴细胞并用含20％胎牛血清的DMEM培养基培养,分为对照组(Control)、ET组、连翘高、中、低剂量组[连翘水煎液(AFS)1+ET、AFS2+ ET、AFS3+ ET]及多黏菌素B组(Ploy B+ET);AFS1+ ET、AFS2+ ET、AFS3+ ET组及Ploy B+ET组分别加入AFS 50.0、25.0、12.5 g/L及多黏菌素B 10 mg/L培养0.5h后,再分别加入10 μg/L ET培养12h;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法检测TLR.及NF-κB表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞分泌IL-6及IL-10的水平.结果 与Control组比较,ET组TLR4、NF-κB表达水平明显升高(1.38 ±0.05比0.47±0.01;2.37±0.09比0.68±0.09,P＜0.01),IL-6及IL-10分泌水平明显增高[(65.96±0.26)ng/L比(16.59±0.23) ng/L; (21.01 ±0.16) ng/L比(9.17±0.14)ng/L,P＜0.01];AFS1+ ET、AFS2+ ET、AFS3+ ET组均能显著减轻上述变化,并呈剂量依赖关系;AFS1+ ET组与Ploy B+ET组比较差异无统计学意义[0.67±0.03比0.74±0.02;1.22±0.12比1.35±0.10; (21.54 ±0.47) ng/L比(22.20士0.40)ng/L;(11.37 ±0.21) ng/L比(11.85±0.20) ng/L,P＞0.05].结论 连翘预处理能降低ET作用下大鼠脾脏淋巴细胞TLR4、NF-κB的表达及IL-6、IL-10的分泌,有抗炎及免疫调节作用.