基于全基因组序列的耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的耐药与毒力研究

目的明确耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（CRAB）临床主要流行株CC92克隆复合群（CC92）基因组中耐药基因和毒力基因的分布,并探讨CRAB耐药和毒力的分子特征。 方法本研究共纳入2019年1～7月自首都医科大学附属北京地坛医院检验科分离的33株CRAB分离株,行细菌全基因组测序研究。利用CLC Genomics Workbench v10.0软件对全基因组测序数据进行序列的质量修整后,开展序列拼接、组装与注释,并进行耐药基因与毒力基因研究,分析CC92克隆复合群CRAB基因组中携带的耐药基因和毒力基因的分布。 结果基因组测序数据分析表明,33株CRAB菌株中30株为CC92型克隆复合群（包括ST195、ST208、ST369和ST540）,2株为ST229型,1株为国际上未报道新序列型别。以上CRAB中包括大量的耐药基因,包括大环内酯类、四环素和链霉素耐药基因在内的8～18个耐药基因,以及包括编码与侵袭和黏附等毒力功能相关的12种毒力基因。同时,本研究发现CC92克隆复合群,除携带碳青霉烯类耐药基因以外,还携带了其他非CC92克隆群不具备的耐药基因（如bla_OXA-66和bla_TEM-1D）和毒力基因（如bauA和bap基因）。此外,在CC92克隆复合群中可能存在大环内脂类耐药基因[msr（E）和mph（E）]、氨基糖苷类的耐药基因（armA）、链霉素耐药基因（strA、strB）与四环素耐药基因[tet（B）]的重组。 结论CC92克隆复合群的CRAB基因组存在大量耐药基因和毒力基因,且存在耐药基因重组现象,迫切需要对CRAB进一步开展全基因组水平监测,为临床病原诊断和治疗提供必要的依据。     

稳定表达荧光素酶的产酸克雷伯菌在评估不同灭菌方法中的应用

目的构建稳定表达荧光素酶基因（lux）的产酸克雷伯菌,旨在更直观地观察产酸克雷伯菌（K. oxytoca）在宿主体内的分布以及评估不同杀菌方法的效果。 方法扩增pBAV1k-T5-Lux质粒的荧光素酶基因簇（Lux A/B/C/D/E）,构建含有Lux A/B/C/D/E基因簇的pBBR1质粒（pBBR1-lux）,并获得能够表达荧光素基因基团的大肠埃希菌（E. coli-pBBR1-lux）。将pBBR1-lux质粒电转化至产酸克雷伯菌感受态细胞,经荧光强度鉴定及菌株的3次传代,筛选能够稳定表达lux基因的产酸克雷伯菌（K. oxytoca-pBBR1-lux）。 结果连接成功的环状质粒产物命名为pBBR1-lux。与大肠埃希菌对照株相比,含E. coli-pBBR1-lux的Luminesence荧光信号值显著升高[15 345（14 676,18 654） vs. 63（60,82）],差异具有统计学意义（t = 21.14、P = 0.035）。K. oxytoca-pBBR1-lux的Luminesence荧光信号值[399 303（265 245,617 192）]显著高于产酸克雷伯菌对照菌株[83（63.5,86.75）],差异具有统计学意义（t = 7.07、P = 0.014）。E. coli-pBBR1-lux和K. oxytoca-pBBR1-lux均能够在Veritas微孔板光度计和小动物成像仪上检测到Luminesence荧光信号。将所得菌株按照1︰10稀释6个梯度,荧光值检测结果显示,Luminesence值随菌落浓度降低而下降。多次传代后pBBR1-lux能够在产酸克雷伯菌中稳定表达荧光素酶,不同理化杀菌方法对产酸克雷伯菌杀菌效果不同,紫外线和84消毒液（10%）是最有效的杀灭产酸克雷伯菌方法。 结论本研究获得了可被微孔板光度计和小动物成像仪检测到的稳定表达荧光素酶的K. oxytoca-pBBR1-lux。