睾丸特异性基因TSF22在小鼠中的表达研究

目的 筛选与精子发生相关的基因。方法 将4、9、18、35、54日龄和6月龄小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交，筛选出差异表达的基因。利用网络信息资源对该基因进行生物学信息分析。RT-PCR分析该基因在小鼠睾丸不同发育阶段及小鼠不同组织中的表达。结果 芯片结果分析筛选出一个差异表达杂交点（GenBank登录号：NM_199034），生物信息学分析发现该基因全长1597bp，含有570bp的完整ORF，编码190个氨基酸、分子量为22．106kDa的蛋白质，我们将其命名为TSF22。RT-PCR分析表明TSF22基因特异性表达于睾丸组织及18日龄小鼠睾丸中。结论 TSF22基因的表达与小鼠精子发生的过程一致，可能在精子发生中起重要作用。     

诱导小鼠骨髓间充质干细胞向雄性生殖细胞的定向分化

目的探讨小鼠骨髓间充质干细胞是否能够在体外被诱导发生向雄性生殖细胞方向的分化。方法从雄性小鼠骨髓中分离能够长期贴壁生长的细胞,并鉴定其是否为间充质干细胞。对分离的细胞进行生殖细胞特异性报告基因标记(stra-8-GFP)。采用视黄酸诱导标记的细胞发生向生殖细胞方向的分化。通过观察报告基因表达和生殖细胞相关基因mRNA表达情况确定是否发生了分化。结果从小鼠骨髓中分离到的贴壁生长的细胞表达间充质干细胞的表面标志CD90、CD44、CD105和Sca-1;细胞在体外可以被诱导分化为成骨、成软骨及成脂肪细胞。报告基因标记的间充质干细胞在被视黄酸诱导2d后开始表达绿色荧光蛋白和生殖细胞相关基因Mvh、Fragilis和Stella的mRNA。未经视黄酸诱导的细胞不表达绿色荧光蛋白和生殖细胞相关基因。结论小鼠骨髓间充质干细胞在体外可以被视黄酸诱导发生向雄性生殖细胞方向的分化。     

新基因TSBAG的生物信息学分析及其在小鼠睾丸组织中的表达

目的：筛选与精子发生相关的睾丸特异性新基因,并探讨其在精子发生过程中所起的作用。方法：将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交,通过杂交信号的比较,筛选出差异表达的基因。用生物信息学软件对该基因进行生物信息学分析。RT-PCR分析该基因在小鼠不同发育阶段睾丸、小鼠不同组织中的表达。结果：通过4日龄、9日龄、18日龄、35日龄、54日龄和6月龄小鼠睾丸的芯片信号比较筛选出一个差异表达功能未知的新基因(GenBank登录号：BC049770),全长891 bp,含有702 bp的完整ORF,编码一个233个氨基酸、相对分子量为26．938 kD的蛋白质,我们将其命名为TSBAG(testis-specific BAG-like protein)。亚细胞定位预测显示,TSBAG基因可能在细胞核中表达。EBI功能域预测发现,在蛋白质序列8-62处有一个BAG功能域。RT-PCR分析表明,TSBAG基因特异性表达于小鼠睾丸组织中且具有时序性表达。TSBAG蛋白在人的同源基因GenBank登录号为AY349359,在233个氨基酸区域内有83%的同源性。结论：TSBAG基因在小鼠睾丸组织中特异性表达,且与小鼠精子发生过程一致。     

新基因TSC43在小鼠和人睾丸组织中的表达分析

目的筛选与精子发生相关的睾丸特异性新基因。方法将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetiix全基因组芯片进行杂交，通过杂交信号的比较，筛选出差异表达的基因。用生物学信息软件对该基因进行生物学信息分析。RT-PCR分析该基因在小鼠不同发育阶段睾丸、小鼠不同组织及人不同组织中的表达。结果通过4、9、18、35、54日龄和6月龄小鼠睾丸的芯片信号比较筛选出一个差异表达基因（GenBank登录号：XM_156106），全长有1364bp，含有1146bp的完整ORF，编码一个有381个氨基酸、分子量为43．578kDa的蛋白质，我们将其命名为TSCA3。亚细胞定位预测显示TSCA3基因可能在细胞核中表达。EBI功能域分析表示该基因可能参与了cAMP依赖的PK（Protein kinase）的锚定。RT-PCR分析表明TSCA3基因特异性表达于小鼠睾丸组织中且具有时序性表达。TSCA3蛋白在人的同源基因GenBank登录号为NM-152539，在381个氨基酸区域内有49％的同源性，人TSC43（hTSC43）基因特异性地表达于人睾丸组织中。结论TSCA3基因的表达与小鼠精子发生的过程一致，在小鼠及人的睾丸组织中特异性表达，显示其可能在精子发生中起着重要作用。     

体外分化过程中小鼠拟胚体的细胞学特征及基因表达模式

目的探讨小鼠胚胎干细胞来源的拟胚体(EBs)形成以及分化发育90d过程中的形态学特征及基因表达模式。方法将小鼠胚胎干细胞通过悬浮培养获得EBs,EBs在不添加其他诱导因子的体系中连续悬浮培养,采用形态学观察、免疫组织化学染色和RT-PCR检测EBs培养过程中的细胞发育分化特征和基因表达模式。结果将胚胎干细胞转移到去除白血病抑制因子(LIF)的悬浮培养液中培养24h左右即可形成EBs;培养3d左右,部分EBs出现简单胚体结构;在EBs分化7d左右,逐步向空腔化胚体发育;培养9d左右,EBs可发育为原始的囊性胚体结构;培养11d左右,EBs形成典型的、结构完整的三胚层结构。HE染色结果显示,发育早期的EBs包含大量尚未完全分化的ES细胞,随着培养时间的延长,EBs向空腔化、囊性胚体发育,逐渐形成类似于早期组织的形态。悬浮培养7周左右,EBs的发育分化基本停止。免疫组织化学染色结果表明,中胚层心肌细胞特异性标志蛋白cTnT,外胚层特异性标志蛋白Nestin在15d的EBs中表达呈阳性。RT-PCR检测也显示形成的EBs表达外胚层特征性基因Vimentin、Nestin,中胚层特征性基因Flk-1、Gata-1和内胚层特征性基因Transthyretin、-αfetoprotein。结论小鼠胚胎干细胞来源的EBs具有分化为3个胚层的能力,EBs形成的三维结构能够有效的启动细胞的分化;EBs来源的三胚层细胞的发育分化时序和特征,将为鉴定胚胎干细胞来源的分化细胞提供重要参照。     

PigM基因在小鼠中的表达及其在精子发生中的功能探讨

目的 筛选与精子发生相关的基因。方法 将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交，通过杂交信号的比较，筛选出差异表达的基因。利用网络信息资源对该基因进行生物学信息分析。RT-PCR分析该基因在小鼠不同发育阶段睾丸及小鼠不同组织中的表达。结果 通过4、9、18、35、54、日龄和6月龄小鼠睾丸的芯片信号比较筛选出一个差异表达杂交点（GenBank登录号：NM．0262_34），生物信息学分析发现该基因全长3979bp，含有1272bp的完整ORF，编码一个有423个氨基酸、分子量为49．788的蛋白质。PigM蛋白与大鼠同源基因PigM蛋白有96％的同源性，与人PigM蛋白有89％的同源性，显示该基因在哺乳动物中高度保守。RT-PCR分析表明Pi州基因特异性表达于睾丸组织及18日龄后的小鼠睾丸中。结论 PigM基因的表达与小鼠精子发生的过程一致，显示其可能在精子发生中起着重要作用。解释该基因的生物学功能，可对揭示人类无精、弱精和少精引起的男性不育的病因，治疗和预防男不育及寻找新的男子避孕药的靶位点具有重要意义。     

双调蛋白在人体子宫内膜组织中的表达特征

目的:研究双调蛋白在人体子宫内膜组织中的表达特征.方法:取增殖期和分泌期的人体子宫内膜,采用实时定量RT-PCR方法,检测双调蛋白mRNA在子宫内膜增殖期和分泌期的表达差异;采用原位杂交和免疫组织化学的方法,从基因和蛋白水平检测双调蛋白在人体子官内膜组织中的表达特征.结果:定量RT-PCR结果显示,双调蛋白mRNA在增殖期和分泌期的子宫内膜均有表达,在分泌期其表达量显著升高,是增殖期的32倍.原位杂交和免疫组织化学结果显示,双调蛋白主要分布于子宫内膜腺体,定位于细胞浆内;双调蛋白mRNA在增殖期和分泌期子宫内膜的表达分别为0.54±0.22和2.96±0.47(P<0.01);双调蛋白在增殖期和分泌期子宫内膜的表达分别为0.77±0.47和2.60±0.43(P<0.01).双调蛋白在分泌期子宫内膜中的表达显著升高,与荧光定量RT-PCR分析的结果相符.结论:双调蛋白在子宫内膜分泌期的表达显著增加,提示该蛋白可能与子宫内膜细胞分化或胚胎着床有关.     

人共刺激分子4—1BBL表达载体的构建及转染Tca8113细胞的研究

目的：克隆人肿瘤坏死因子配体超家族tumor necrosis factor superfamily，TNFSF）成员4—1BBL基因，构建其真核表达载体，并检测4—1BBL基因在Tca8113中的表达。方法：从淋巴细胞中提取RNA，用RT—PCR方法将4—1BBL的编码序列cDNA扩增。然后将该基因的编码序列插入真核荧光蛋白载体pEGFP—C1质粒中，构建成最终的表达载体DEGFP—C1—4—1BBL。运用脂质体方法将pEGFP—C1—4—1BBL转染Tca8113细胞，转染24h后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达．RT—PCR和免疫印迹检测4—1BBL在该细胞中的表达。经G418筛选后。用有限稀释法建立稳定高表达的带有4—1BBL基因的Tca8113细胞系。结果：从淋巴细胞中提取的RNA经RT—PCR扩增出目的基因4—1BBL，其全长大小为768bD。测序鉴定该序列与GenBank中的序列相同。转染pEGFP—C1—4—1BBL载体的靶细胞Tca8113中．荧光显微镜下可见其表达绿色荧光蛋白，RT—PCR方法检测到目的基因4—1BBL的768bp大小的cDNA扩增产物。裂解的4—1BBL／rca8113基因转染细胞膜蛋白中相对分子质量约27．5Kd的特异性条带。结论：转染4—1BBL基因细胞株的建立．为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。     

人胚胎干细胞H1培养条件的优化

目的:采用不同培养基和饲养层培养人胚胎干细胞H1,建立适合H1细胞增殖的最佳条件并分析其基本生物学特性。方法:鼠源性饲养层采用ICR品系小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),人源性饲养层采用人胚胎成纤维细胞系(HFF-1)。H1基本培养基配制分别采用传统DMEM/F12和改良培养基Knock-outTM DMEM。实验共分为MEF DMEM/F12、MEF K-DMEM、HFF DMEM/F12、HFF K-DMEM组。H1基本生物学特性检测采用免疫荧光、RT-PCR、碱性磷酸酶和核型分析。结果:MEF DMEM/F12组中H1克隆形态规则,不发生分化,增殖速度快;而MEF K-DMEM组细胞克隆传代后第4日发生分化;HFF DMEM/F12组和HFF K-DMEM组细胞传代后第3日就显示出分化趋势,克隆变扁。MEF DMEM/F12组中H1细胞保持正常核型和基本生物学特性。结论:不同的人胚胎干细胞系最佳培养条件是不同的,建立的MEF DMEM/F12组培养条件最适合H1细胞增殖。     

双调蛋白在人体睾丸组织的表达特征

目的确定双调蛋白在人体睾丸组织和精子的表达特征,比较双调蛋白在正常人和隐睾症患者睾丸组织的表达差异。方法收集正常睾丸组织、精液精子和隐睾症患者的睾丸组织,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学的方法检测双调蛋白的表达水平。结果双调蛋白在正常睾丸组织和精子均有表达,主要分布于睾丸长型精子细胞和成熟精子尾部;与正常睾丸组织比较,双调蛋白在隐睾组织的表达显著减少、隐睾组织生精小管的表达基本消失。结论在隐睾症睾丸中双调蛋白的表达显著减少,提示双调蛋白表达与睾丸发育有一定关系。