基因芯片分析稳定转染HBx基因的HepG2肝癌细胞对人脐静脉血管内皮细胞基因的差异表达

目的采用基因芯片技术筛选稳定转染HBx基因的HepG2肝癌细胞对人脐静脉血管内皮细胞的差异表达基因。方法①以人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)为细胞模型,通过transwell共培养技术,分别将肝癌细胞HepG2及稳定转染HBx基因肝癌细胞HepG2(HepG2-X)与HUVEC共培养。②分别提取细胞总RNA,通过基因芯片技术筛选差异表达基因。结果有643条基因差异表达明显,其中UBR3、ATXN3等19条基因经HBx干预后表达量明显上升,FOLR1、HSPs、ZNF等624条明显下降。结论利用基因芯片技术可以筛选HBx参与的肝癌血管生成差异表达基因,为肝癌的诊治、预防提供一定的理论依据。     

CEACAM1表达与乙肝相关性肝癌微血管生成的关系

目的：探讨癌胚抗原相关细胞黏附分子1（CEACAM1）在乙肝相关性肝癌中的表达与微血管生成的关系。方法：采用免疫组织化学方法（SP法）检测81例乙肝相关性肝癌组织中CEACAM1及CD105的表达情况,分析CEACAM1和CD105标记的MVD与乙肝相关性肝癌临床病理特征的关系。结果：81例乙肝相关性肝癌组织中CEACAM1表达阳性率为71.60%（58/81）,CD105在本组肝癌组织中的阳性表达率为100%（81/81）,CEACAM1及CD105-MVD分别与肿瘤直径、包膜浸润、门静脉侵袭、淋巴结转移和TNM分期密切相关（P〈0.05）,其中CEACAM1阳性组MVD值与阴性组间差异具有统计学意义（t=3.588,P=0.001）,CEACAM1阴性组MVD值较高。结论：乙肝相关性肝癌中CEACAM1的表达下调可能参与肿瘤微血管生成,提高其侵袭及转移能力。     

院前亚低温治疗重型颅脑损伤的应用研究

目的 研究院前亚低温对重型颅脑损伤患者的脑保护作用.方法 将由急救车送至本院的86名重型颅脑损伤患者采用随机数字表法随机分成两组:院前亚低温组和晚期亚低温组.院前亚低温组患者入院前保持患者鼻咽部温度33℃～35℃,入院或手术后改为亚低温治疗仪(降温毯)进行亚低温治疗4天后自然复温.晚期亚低温组患者在入院或手术后开始使用亚低温治疗仪进行同样的亚低温治疗作为对照.同时监测两组的脑温、生命体征、颅内压力、并发症和GOS评分.结果 院前亚低温组在治疗后24、48和72 h的颅内压分别为(17.38±4.88mmHg,18.40±4.50 mmHg,16.40±4.13 mmHg)均较晚期亚低温组(20.63±3.00 mmHg,21.80±6.00 mmHg 18.81±4.50 mmHg)明显降低(P＜0.05);院前亚低温组恢复良好率、病死率与晚期亚低温组相比较有显著差异(P ＜0.05),预后(GOS评分4～5分)明显好于晚期亚低温组(P＜0.05);院前亚低温组未发生与亚低温治疗相关的严重并发症.结论 院前亚低温用于重型颅脑损伤患者的治疗,具有降低颅内压、改善预后的作用.     

泛素结合酶基因生物信息学与功能分析

目的：生物信息学的发展为通过在线软件预测新基因的相关信息提供了众多有重要价值的参考信息。文中利用生物信息学方法预测泛素结合酶2S（ ubiquitin-conjugating enzyme 2S, UBE2S）生物学功能。方法以人肝癌HepG2细胞为材料,从构建的cDNA文库基因组中筛选和克隆了UBE2S基因。利用NCBI的BLAST在线分析工具分别对GenBank的非冗余核酸数据库和非冗余蛋白质数据库序列进行比对分析;采用NCBI ORF finder在线分析工具预测开放阅读框;利用ExPASy在线工具ProtParam统计基因中各种氨基酸含量,并预测理论分子量和等电点;应用ProtScale程序进行蛋白质的疏水性分析;蛋白质亚细胞定位采用在线工具（ nibb．ac．jp／form．html）预测,通过NCBI数据库GenBank分析蛋白质保守结构域;采用Protfun在线工具预测UBE2S的功能分类;采用同源模型服务软件SWISS-MODEL预测UBE2S的三维结构;采用MEGA5．05软件进行系统进化树的构建。结果 UBE2S基因编码241个氨基酸,预测相对分子质量为23770,理论等电点为8．81。跨膜结构域分析表明,UBE2S蛋白不含跨膜位点;亚细胞定位预测,UBE2S蛋白具有生长因子、离心通道、结构蛋白功能的概率为8．904、0．313和0．291。同源性比较分析结果表明,其碱基序列与已经报道的其他12个物种的相似率为90％～97％,且符合种属之间的进化关系。结论 UBE2S蛋白结构和功能的分析不仅丰富了其家族基因信息,还将为后续肝癌发生发展的分子机制实验研究奠定基础。     

癌胚抗原相关细胞黏附分子1和血管内皮生长因子在HBV相关性肝癌血管生成中的作用

目的 研究癌胚抗原相关细胞黏附分子1 (CEACAMl)和血管内皮生长因子(VEGF)在HBV相关性肝癌组织中的表达与HBV相关性肝癌血管生成的关系.方法 采用免疫组织化学SP法检测81例HBV相关性肝癌组织中CEACAM1、VEGF的表达,光镜下计数CD105标记的微血管密度(MVD).结果 81例HBV相关性肝癌组...     

前列腺癌组织中AQP_1的表达及其与肿瘤血管生成的关系

目的检测水通道蛋白-1（aquaporin-1,AQP1）和CD105在前列腺癌组织中的表达及其与肿瘤血管生成的关系。方法采用免疫组化二步法检测23例前列腺增生组织、52例前列腺癌组织中AQP1蛋白和CD105的表达情况,并计数CD105标记的微血管密度。结果 AQP1在前列腺癌组织阳性表达率明显高于前列腺增生组织（71.15%vs 28.85%）。前列腺癌组织中MVD明显高于前列腺增生组织（20.13±2.84 vs 5.32±1.73,P〈0.01）。AQP1阳性组的MVD明显高于阴性组,两者密切相关。AQP1蛋白表达和MVD与患者年龄、肿瘤大小无关,而与肿瘤分化程度及临床分期呈正相关系。结论结果提示前列腺癌中存在AQP1的高表达,其与CD105可能在前列腺癌的发展过程中起重要作用,两者结合可能成为前列腺癌病变生物学行为的重要指标。     

自噬在高糖条件下视网膜色素上皮细胞表达血管内皮生长因子促进RF/6A细胞血管生成中的作用

目的　研究高糖条件下诱导的人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19）自噬对其表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），及恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）迁移和管腔形成的影响。方法　根据不同干预将ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组及3-甲基腺嘌呤（3-MA）+高糖组。对照组细胞在无糖DMEM培养基中常规培养24 h，高糖组细胞在DMEM培养基中加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h，3-MA+高糖组细胞先用10 mmol·L^-1 3-MA处理24 h，然后更换培养基再加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h。Western blot法检测细胞自噬标志性蛋白微管相关蛋白1 轻链 3（microtubule-related protein 1 light chain 3，LC3）II型和I型的比值(LC3-II/LC3-I)、Beclin-1及细胞中自噬相关基因3（autophagy-related gene 3，Atg3）的蛋白表达。ELISA法检测ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达。比较三组ARPE-19细胞LC3-II/LC3-I、Beclin-1、Atg3及VEGF的蛋白表达量。然后将以上三组ARPE-19细胞上清液分别加入RF/6A细胞培养基中，将RF/6A细胞也按以上方法分组，分别采用Transwell法及Matrigel胶法检测并比较三组RF/6A细胞迁移数及细胞管腔形成数。结果　对照组、高糖组和3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比值分别为0.405±0.095、0.932±0.024和0.635±0.048；Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.205±0.035、0.590±0.120和0.425±0.082；Atg3蛋白相对表达量分别为0.277±0.035、0.539±0.071和0.389±0.019。ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达量三组分别为（44.03±9.08）ng·L^-1、（205.70±17.90）ng·L^-1和（112.52±21.06）ng·L^-1；RF/6A细胞迁移数三组分别为（125.60±6.35）个、（153.60±19.20）个和（67.40±7.95）个；细胞管腔形成数三组分别为（12.22±0.84）个、（18.44±1.68）个和（5.44±0.51）个；整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与对照组相比，高糖组ARPE-19细胞的LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1及Atg3蛋白相对表达量均明显增加（均为P<0.01），VEGF表达水平均明显升高（P<0.01），RF/6A细胞迁移数和管腔形成数均明显增加（均为P<0.01），3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/I比值、Beclin-1和Atg3蛋白相对表达量、VEGF表达量、RF/6A细胞迁移数和细胞管腔形成数均较高糖组明显降低（均为P<0.01）。结论　高糖激活ARPE-19细胞自噬，进而上调VEGF的表达并促进RF/6A细胞迁移和管腔形成，自噬抑制剂3-MA可抑制ARPE-19细胞自噬，并下调VEGF的表达从而抑制RF/6A细胞的血管形成能力。     

糖尿病视网膜病变分级诊疗措施初探

糖尿病视网膜病变是糖尿病患者群体在临床病程的持续发展演化过程中,因多种因素的影响而发生的严重并发症,是临床中引致病理性致盲事件发生的重要因素,切实做好针对糖尿病视网膜病变发生的管理干预工作,对于控制和降低患者严重并发症的发生具有重要意义。2017年国家卫生计生委办公厅为了做好糖尿病视网膜病变防治工作,结合糖尿病分级诊疗要求,研究制定了《糖尿病视网膜病变分级诊疗服务技术方案》,通过分级诊疗制度的实施,有助于早期发现糖尿病视网膜病变,并给予早期干预,从而降低患者的疾病负担。但是在该服务技术方案实施过程中,具体的实施措施仍有待进一步细化、完善。该文针对糖尿病视网膜病变分级诊疗的措施,进行初步探讨。     

自噬抑制剂3-MA对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞表达TNF-α的抑制作用

目的研究自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对缺氧条件下人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。方法将体外培养的ARPE-19细胞随机分为对照组、缺氧组和3-MA+缺氧组,对照组细胞在常氧条件下培养,缺氧组细胞在缺氧箱(1%O2/5%CO2/94%N2)中进行培养,3-MA+缺氧组先在培养基中加入10 m M 3-MA,然后置于缺氧箱中继续培养。采用Western blot法检测各组细胞的自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 B (LC3B)、Beclin-1及p62的表达;采用ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α的浓度。结果 (1)对照组、缺氧组、3-MA+缺氧组细胞的TNF-α浓度分别为(59. 46±5. 22) pg/ml、(135. 80±11. 30) pg/ml和(105. 88±10. 42) pg/ml,总体比较差异有统计学意义(F=50. 53,P=0. 000),缺氧组的TNF-α浓度明显高于对照组和3-MA+缺氧组,差异均有统计学意义(均P <0. 01),3-MA+缺氧组的TNF-α浓度高于对照组,差异有统计学意义(P <0. 01)。(2)对照组、缺氧组、3-MA+缺氧组细胞中的LC3B-II/LC3B-I值、Beclin-1值及p62值分别为(0. 20±0. 03、0. 58±0. 07和0. 40±0. 09)、(0. 32±0. 04、0. 97±0. 05和0. 78±0. 06)和(1. 03±0. 02、0. 32±0. 10和0. 78±0. 08),组间总体比较差异均有统计学意义(LC3B-II/LC3B-I:F=21. 73,P=0. 002; Beclin-1:F=149. 34,P=0. 000; p62:F=69. 53,P=0. 000)。缺氧组细胞中LC3B-II/LC3B-I值和Beclin-1值均明显高于对照组和3-MA+缺氧组,差异均有统计学意义(均P <0. 05),3-MA+缺氧组的LC3B-II/LC3B-I值和Beclin-1值均高于对照组,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。缺氧组细胞中p62值明显低于对照组和3-MA+缺氧组,差异均有统计学意义(均P <0. 01),3-MA+缺氧组的p62值低于对照组,差异有统计学意义(P <0. 01)。结论缺氧激活RPE细胞自噬并促进其TNF-α的表达,自噬抑制剂3-MA可在一定程度上抑制自噬进程,从而发挥抑制细胞表达TNF-α的作用。     

融合表达载体pET22b-SUMO-FGFR4的构建及其在大肠杆菌中表达条件的优化

目的：设计合成小泛素修饰物-成纤维细胞生长因子受体4（SUMO-FGFR4）基因,构建pET22b-SUMO-FGFR4表达载体,并对其表达条件进行优化。方法：采用Overlap PCR方法制备SUMO-FGFR4融合基因,并连接到原核表达载体pET22b中,获得pET22b-SUMO-FGFR4重组表达载体。以乳糖为诱导剂,观察乳糖浓度、诱导时机、诱导温度、诱导时间和乳糖的添加方式等因素对SUMO-FGFR4蛋白表达量的影响,确定最佳诱导条件,并进行重组蛋白的可溶性分析。结果：pET22b-SUMO-FGFR4表达的融合蛋白在相对分子质量40000处显示目标条带,并与FGFR4抗体特异性结合。融合蛋白在乳糖终浓度为1.0 g·L^-1、诱导时间为3 h、诱导时机A（600）值为 0.8、诱导温度为37 ℃时表达量最高,乳糖的添加方式对SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量无明显影响。乳糖作为诱导剂比传统诱导剂IPTG诱导SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量高7.5%,融合蛋白以包涵体形式为主。结论：以乳糖作为诱导剂,成功表达了SUMO-FGFR4融合蛋白,确定了融合蛋白的最佳表达条件。