人髓核细胞诱导人尿源性干细胞向髓核样细胞分化作用的研究

【摘要】 目的：探讨人髓核细胞（NPCs）诱导对人尿源性干细胞（USCs）向髓核样细胞分化的作用。方法：手术时获取腰椎间盘突出症患者L4/5的髓核组织,并采用贴壁法体外分离培养NPCs;从健康成年人尿液中获取USCs并进行体外培养,通过倒置显微镜观察细胞形态,并采用成骨、成脂、成软骨三系诱导分化及蛋白免疫印迹技术（Western blot,WB）对所获取的USCs进行形态、分化潜能及细胞表面标志蛋白鉴定。使用Transwell小室将P3代NPCs与USCs培养以建立共培养体系,设实验组、对照组及NPCs组,实验组为NPCs与USCs共培养组,对照组为单独USCs培养,NPCs组为单独NPCs培养;培养14d后应用倒置显微镜观察细胞形态;应用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）及WB分别检测实验组USCs、对照组USCs与NPCs组NPCs中蛋白多糖（ACAN）、SOX-9（SRY-related high mobility groupbox gene 9）、Ⅱ型胶原（COL2）及缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的mRNA及蛋白的表达情况;免疫荧光染色观察3组 COL2A1及ACAN荧光表达。结果：培养的USCs成骨、成脂、成软骨三系分化实验结果均为阳性;USCs中干细胞阳性标志物CD29、CD44、CD73和CD90呈高表达,未检出干细胞阴性标志物CD34和CD45。培养14d后倒置显微镜下对照组及NPCs组细胞形态无变化,实验组USCs向髓核样细胞分化,形态变化明显。经共培养诱导14d后实验组及NPCs组中的ACAN、SOX-9、COL2A1及HIF-1α基因mRNA及蛋白表达均显著高于对照组（P<0.05）,ACAN及COL2A1荧光强度明显高于对照组;实验组上述各种mRNA及蛋白表达与NPCs组比较均无统计学差异（P＞0.05）,实验组荧光强度与NPCs组比较无明显差异。结论：在体外实验中,人NPCs可通过共培养的方式诱导人USCs分化为髓核样细胞,可为椎间盘组织工程研究提供NPCs来源。     

人尿源干细胞外泌体对退变髓核细胞生物学功能的影响

目的:探讨人尿源干细胞外泌体(USC-Exos)对退变髓核细胞(NPCs)生物学功能的影响。方法 :从健康成人尿液中获得人尿源干细胞(USCs)并进行体外培养,通过成骨、成软骨、成脂诱导分化及蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)技术对所提取细胞进行鉴定。使用USCs完全培养基培养USCs 48h后采用差速离心法从培养基中提取外泌体,应用电子显微镜、粒径分析及WB技术对USC-Exos进行形态、直径及表面标志物检测。从腰椎间盘突出症患者术中摘除的髓核中提取NPCs,并培养至P6。以加入50μg/ml USC-Exos干预的P6NPCs为实验组,以50μg/ml未培养过细胞的USCs完全培养基离心沉淀物干预的P6 NPCs为对照组,分别在干预后1～6d使用CCK-8法检测NPCs增殖情况。使用PKH26荧光染料标记USC-Exos,并用标记后的USCExos干预P6 NPCs,12h后在激光共聚焦显微镜下观察NPCs对USC-Exos的摄取情况。两组在干预后48h进行β-半乳糖苷酶衰老染色检测NPCs衰老比例,免疫荧光染色观察蛋白聚糖(ACAN)、Ⅱ型胶原(COL2)的表达。干预后3d、5d、7d时用RT-PCR和WB检测两组NPCs中ACAN、COL2、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)、多肿瘤抑制基因P16(P16)的mRNA及对应蛋白的表达量,对两组ACAN、COL2、TIMP1、P16基因的相对表达量进行比较,P0.05为有统计学差异。结果:从人尿中提取的细胞具有干细胞特性,传代培养后可从中提取粒径为50～100nm的椭圆形囊泡结构,其表达CD63和Tsg101,不表达Calnexin蛋白,符合Exos特性。P6 NPCs经USC-Exos干预后细胞增殖速度变快。经PKH26标记的USC-Exos可被NPCs摄取。干预后48h实验组衰老细胞比例[(13.8±1.4)%]低于对照组[(19.6±2.4)%],ACAN、COL2的荧光强度高于对照组。干预后3d、5d、7d时,实验组细胞中ACAN、COL2、TIMP1 mRNA及对应蛋白的相对表达量较对照组显著性升高(P0.05),P16基因mRNA及对应蛋白的相对表达量较对照组显著性降低(P0.05),而同组内不同时间点比较无显著性差异。结论:USC-Exos在体外条件下可促进退变NPCs的增殖,提高退变NPCs中ACAN、COL2、TIMP1 mRNA及对应蛋白的表达,降低P16 mRNA及对应蛋白的表达。     

脊柱外科中脑脊液漏的治疗和预防

目的探讨脊柱外科中脑脊液漏的治疗和预防,提高患者的治疗效果。方法分析该院自2009年12月—2013年6月以来收治的30例脊柱外科中并发脑脊液漏患者,术中均发现硬脊膜破裂,行修补硬脊膜漏口,观察患者的临床治疗效果,并结合愈合周期讨论脑脊液漏的预防。结果该组30例脊柱外科术中并发脑脊液漏患者的伤口经过有效的保守治疗措施,全部痊愈,达到了100%,无一例发生脑脊髓膜炎、神经纤维疝、切口不愈合等严重并发症,大部分患者的伤口引流管在外科手术结束后的4~7 d拔除,引流口经缝合后完全愈合。结论通过术中对粘连硬膜的反复探查、仔细分离及对破裂硬脊膜采取及时的修补手术,采取有效的术后预防和系统治疗措施,可以缩短患者的愈合周期,以达到良好临床效果。     

颈椎前路去后纵韧带减压对颈性眩晕中短期疗效分析

目的研究颈椎前路去后纵韧带减压对颈性眩晕中短期疗效。方法将2012年3月-2013年8月期间在我院接受颈椎前路手术的颈性眩晕患者纳入研究,根据手术方法不同分为接受去后纵韧带减压手术的观察组和保留后纵韧带减压手术的对照组,观察两组患者的手术相关指标、术后颈性眩晕症状与功能评分。结果两组患者手术时间、术后出血量的差异无统计学意义;术后卧床时间、颈性眩晕症状与功能评分均低于对照组。结论颈椎前路去后纵韧带减压有助于促进术后恢复、改善颈性眩晕症状,且取得与保留后纵韧带手术相当的创伤程度。     

颈椎前路椎间盘切除融合术后颈长肌、颈伸肌变化与临床疗效的相关性

目的:评估颈椎前路椎间盘切除融合术（anterior cervical discectomy and fusion,ACDF）后颈长肌、颈伸肌的容积变化,以及其与临床疗效的相关性。方法:回顾性分析2013年1月至2018年12月接受单节段ACDF手术治疗的脊髓型颈椎病患者57例,随访时间为（23.0±4.8）个月（范围...