碱性成纤维细胞生长因子和神经生长因子联合诱导成年鼠骨髓基质细胞向神经元样细胞的分化

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子和神经生长因子联合诱导成年大鼠骨髓基质细胞分化为神经细胞的可能性和条件，为神经细胞的再生和脊髓内移植提供实验基础。 方法：实验于2005—07／10在锦州医学院附属第一医院骨科实验室完成。选取清洁级、鼠龄1个月SD大鼠1只，拉颈处死后无菌条件下取出股骨，除去骨周围的肌肉组织，剪开骨两端，显露骨髓腔，以IMDM培养液从一端冲洗骨髓腔，将骨髓冲到平皿中，进行骨髓基质细胞的分离培养，传至第5代的骨髓基质细胞用于实验。诱导前24h先用含1μg／L碱性成纤维细胞生长因子及体积分数为0．2的胎牛血清的DMFM培养液培养，以促进细胞分裂，然后用神经生长因子作诱导剂，观察细胞形态的变化，并采用免疫组织化学法检测诱导后细胞表达神经丝蛋白、神经元烯醇化酶等特异性标志物情况。 结果：①原代和传代培养时大鼠骨髓基质细胞的生长情况；原代培养2～4d细胞处于静止状态。第五六天可见有贴壁细胞开始伸展为椭圆型、短梭型、长梭型等，这些细胞即为骨髓间充质干细胞。至第14天骨髓基质细胞基本铺满瓶底，此时即可传代。传代后2-4d第1代细胞基本处于静止状态，第5天开始缓慢增殖，约在第8天长满瓶底，传代周期为六七天。②碱性成纤维细胞生长因子与神经生长因子联合诱导后骨髓基质细胞的形态变化：经碱性成纤维细胞生长因子预诱导2h后，骨髓基质细胞形态无明显变化，但胞体变大。神经生长因子诱导12h后，部分细胞分化，胞体向胞核收缩呈锥形，类似神经细胞，细胞突起之间呈渐进性变化，但无明显增殖现象。③大鼠骨髓基质细胞分化后的鉴定和。转化率的测定：神经样细胞的胞体与突起，神经元烯醇化酶（γ-γ）和神经丝蛋白染色呈强阳性，而未分化的骨髓基质细胞为阴性。定量计数分析表达神经元烯醇化酶（γ—γ）为（69．6&;#177;3．8）％，表达神经丝蛋白为（71．3&;#177;3．3）％。 结论：碱性成纤维细胞生长因子和神经生长因子联合应用能将骨髓基质细胞诱导成神经元样细胞，预诱导24h后撤离二者可增加细胞转化率，促进诱导后的细胞成熟，为细胞移植治疗脊髓损伤提供一种高效种子细胞生产方法。     

组织工程神经支架修复周围神经缺损的应用与前景

周围神经缺损过去一直是困扰医学界的难题，组织工程神经支架的出现为周围神经缺损的修复开辟了广阔的前景和思路。将神经支架修复神经缺损的研究进展作一综述，并通过分析指出：复合型组织工程神经支架在长段神经缺损的修复中在理论和实际上具有明显的优势，是未来本领域的研究发展方向。     

酶组织化学法观察缺血预处理对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的：采用酶组织化学法观察缺血预处理对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤是否有保护作用。 方法：实验于2005-07／10在锦州医学院药理实验室完成。选取健康清洁级1月龄S皿大鼠24只，随机分为3组：假手术对照组、缺血再灌注组、经典缺血预处理组，8只／组。①缺血再灌注组和经典缺血预处理组大鼠建立骨骼肌缺血／再灌注模型。大鼠腹腔麻醉后沿股鞘切开皮肤，分离股动静脉，制成切断患肢皮肤、肌肉和神经，仅保留股动静脉，用微血管夹阻断股动脉血供，制成右后肢缺血模型。②缺血再灌注组大鼠造模后缺血60min，再灌注20min。经典缺血预处理组大鼠用无创伤血管夹阻断股动静脉，给予10min的短暂缺血及10min的再灌注，3次循环后再次阻断股动静脉，缝合左大腿前方皮肤切口，缺血60min，剪开左大腿前方切口取出无创伤血管夹，观察血流恢复无血栓形成后，在动脉血流恢复的情况下可观察到患肢鼠爪由暗紫色转变为粉红色，再灌注20min。假手术对照组大鼠只穿线不结扎，股动脉旷置50min。③通过光镜观察各组骨骼肌结构的变化，同时以黄嘌呤氧化酶法测定各组大鼠骨骼肌组织的超氧化物歧化酶活性，硫代巴妥酸法测定丙二醛含量，酶组织化学法测定过氧化氢酶活性和琥珀酸脱氢酶活性。 结果：实验选取健康清洁级SD大鼠24只，全部进入结果分析。①造模后光镜下各组大鼠肌细胞形态学观察结果：假手术对照组肌细胞正常，肌纤维完整；缺血再灌注组肌细胞部分溶解，肌纤维扭曲、断裂；经典缺血预处理组肌细胞点片状坏死，肌纤维基本完整。②各组大鼠血清丙二醛和总超氧化物歧化酶含量的比较：与缺血再灌注组比较，经典缺血预处理组的血清丙二醛含量明显降低[（11．22&;#177;0．94），（7．67&;#177;1．21）μmol／L，P〈0．05]，血清总超氧化物歧化酶含量明显升高[（97．97&;#177;7．71），（145．74&;#177;11．07）Nu／mL，P〈0．05]。③各组大鼠骨骼肌过氧化氢酶和琥珀酸脱氢酶活性的变化：与缺血再灌注组比较，经典缺血预处理组过氧化氢酶和琥珀酸脱氢酶活性均明显升高[（10423．4&;#177;3357．4），（28410．2&;#177;2925．3）个，P〈0．05；（44．30&;#177;9．75），（63．00&;#177;9．72）A，P〈0．05]。 结论：大鼠骨骼肌组织在缺血前给予缺血预处理，能够增强骨骼肌的抗氧化能力，提高骨骼肌对缺血再灌注损伤的耐受程度。提示酶组织化学法可以较准确地反映缺血预处理具有保护心肌结构和抗氧化效应。     

碱性成纤维细胞生长因子和神经生长因子联合诱导成年鼠骨髓基质细胞向神经元样细胞的分化

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子和神经生长因子联合诱导成年大鼠骨髓基质细胞分化为神经细胞的可能性和条件,为神经细胞的再生和脊髓内移植提供实验基础。方法:实验于2005-07/10在锦州医学院附属第一医院骨科实验室完成。选取清洁级、鼠龄1个月SD大鼠1只,拉颈处死后无菌条件下取出股骨,除去骨周围的肌肉组织,剪开骨两端,显露骨髓腔,以IMDM培养液从一端冲洗骨髓腔,将骨髓冲到平皿中,进行骨髓基质细胞的分离培养,传至第5代的骨髓基质细胞用于实验。诱导前24h先用含1μg/L碱性成纤维细胞生长因子及体积分数为0.2的胎牛血清的DMFM培养液培养,以促进细胞分裂,然后用神经生长因子作诱导剂,观察细胞形态的变化,并采用免疫组织化学法检测诱导后细胞表达神经丝蛋白、神经元烯醇化酶等特异性标志物情况。结果:①原代和传代培养时大鼠骨髓基质细胞的生长情况:原代培养2～4d细胞处于静止状态。第五六天可见有贴壁细胞开始伸展为椭圆型、短梭型、长梭型等,这些细胞即为骨髓间充质干细胞。至第14天骨髓基质细胞基本铺满瓶底,此时即可传代。传代后2～4d第1代细胞基本处于静止状态,第5天开始缓慢增殖,约在第8天长满瓶底,传代周期为六七天。②碱性成纤维细胞生长因子与神经生长因子联合诱导后骨髓基质细胞的形态变化:经碱性成纤维细胞生长因子预诱导2h后,骨髓基质细胞形态无明显变化,但胞体变大。神经生长因子诱导12h后,部分细胞分化,胞体向胞核收缩呈锥形,类似神经细胞,细胞突起之间呈渐进性变化,但无明显增殖现象。③大鼠骨髓基质细胞分化后的鉴定和转化率的测定:神经样细胞的胞体与突起,神经元烯醇化酶(γ-γ)和神经丝蛋白染色呈强阳性,而未分化的骨髓基质细胞为阴性。定量计数分析表达神经元烯醇化酶(γ-γ)为(69.6±3.8)%,表达神经丝蛋白为(71.3±3.3)%。结论:碱性成纤维细胞生长因子和神经生长因子联合应用能将骨髓基质细胞诱导成神经元样细胞,预诱导24h后撤离二者可增加细胞转化率,促进诱导后的细胞成熟,为细胞移植治疗脊髓损伤提供一种高效种子细胞生产方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养贴壁分离和消化控制相结合可否为简便高效的技术方法

目的:对骨髓间充质干细胞的培养一般采用流式细胞仪分离法及密度梯度离心法和免疫磁珠分离法,本实验观察了采用贴壁分离和消化控制相结合方法分离纯化的可行性。方法:实验于2004-09/12在锦州医学院附属第一医院外科实验室完成。选取6～8周龄的SD大鼠,雌雄不限,从其股骨、胫骨中取材,在无菌条件下操作,用剪刀分别剪去股骨胫骨的两端,暴露骨髓腔,用含有体积分数为0.15的胎牛血清Dulbecco改良培养基从骨髓腔中冲出骨髓于平皿中,用含有体积分数为0.1的胎牛血清的Dulbecco改良培养基培养,用消化控制及贴壁分离法分离纯化骨髓间充质干细胞,并观察其生长状态,测定骨髓间充质干细胞的生长曲线,分裂指数,贴壁率,用免疫细胞化学方法对骨髓间充质干细胞进行表型分析。结果:原代培养的骨髓间充质干细胞呈椭圆型、短梭型、长梭型、多角型等。纯化、扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭型,第6代前生长性状稳定,增殖能力强。传代周期为7d,每次传代时细胞活力测定均>97%,传代后24h内贴壁率99%。免疫细胞化学检测第3代细胞均匀表达CD54(ICAM-1)、纤维连接蛋白。结论:实验建立了一种可行的大鼠骨髓间充质干细胞取材、纯化、扩增方法。培养的骨髓间充质干细胞纯度高,细胞活力强,生物学性状稳定。本实验通过贴壁分离和消化控制相结合的培养方法具有操作简便,条件要求低等优点,是目前一种比较理想的分离纯化方法。     

酶组织化学法观察缺血预处理对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的:采用酶组织化学法观察缺血预处理对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤是否有保护作用。方法:实验于2005-07/10在锦州医学院药理实验室完成。选取健康清洁级1月龄SD大鼠24只,随机分为3组:假手术对照组、缺血再灌注组、经典缺血预处理组,8只/组。①缺血再灌注组和经典缺血预处理组大鼠建立骨骼肌缺血/再灌注模型。大鼠腹腔麻醉后沿股鞘切开皮肤,分离股动静脉,制成切断患肢皮肤、肌肉和神经,仅保留股动静脉,用微血管夹阻断股动脉血供,制成右后肢缺血模型。②缺血再灌注组大鼠造模后缺血60min,再灌注20min。经典缺血预处理组大鼠用无创伤血管夹阻断股动静脉,给予10min的短暂缺血及10min的再灌注,3次循环后再次阻断股动静脉,缝合左大腿前方皮肤切口,缺血60min,剪开左大腿前方切口取出无创伤血管夹,观察血流恢复无血栓形成后,在动脉血流恢复的情况下可观察到患肢鼠爪由暗紫色转变为粉红色,再灌注20min。假手术对照组大鼠只穿线不结扎,股动脉旷置50min。③通过光镜观察各组骨骼肌结构的变化,同时以黄嘌呤氧化酶法测定各组大鼠骨骼肌组织的超氧化物歧化酶活性,硫代巴妥酸法测定丙二醛含量,酶组织化学法测定过氧化氢酶活性和琥珀酸脱氢酶活性。结果:实验选取健康清洁级SD大鼠24只,全部进入结果分析。①造模后光镜下各组大鼠肌细胞形态学观察结果:假手术对照组肌细胞正常,肌纤维完整;缺血再灌注组肌细胞部分溶解,肌纤维扭曲、断裂;经典缺血预处理组肌细胞点片状坏死,肌纤维基本完整。②各组大鼠血清丙二醛和总超氧化物歧化酶含量的比较:与缺血再灌注组比较,经典缺血预处理组的血清丙二醛含量明显降低[(11.22±0.94),(7.67±1.21)μmol/L,P<0.05],血清总超氧化物歧化酶含量明显升高[(97.97±7.71),(145.74±11.07)Nu/mL,P<0.05]。③各组大鼠骨骼肌过氧化氢酶和琥珀酸脱氢酶活性的变化:与缺血再灌注组比较,经典缺血预处理组过氧化氢酶和琥珀酸脱氢酶活性均明显升高[(10423.4±3357.4),(28410.2±2925.3)个,P<0.05;(44.30±9.75),(63.00±9.72)A,P<0.05]。结论:大鼠骨骼肌组织在缺血前给予缺血预处理,能够增强骨骼肌的抗氧化能力,提高骨骼肌对缺血再灌注损伤的耐受程度。提示酶组织化学法可以较准确地反映缺血预处理具有保护心肌结构和抗氧化效应。     

化学萃取的异种神经修复神经缺损的可行性研究

目的 探讨联合应用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)的化学萃取方法,对异种神经移植段进行脱细胞处理,构建异种神经去细胞基质膜管,应用于修复周围神经缺损的可行性.方法 取新鲜兔坐骨神经,切成长10mm的神经段,用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)反复处理新鲜的兔神经段构建成异种神经去细胞基质膜管,修复大鼠坐骨神经缺损.结果 4个月后异种神经基质膜管与大鼠坐骨神经缝合处愈合良好,未见有神经瘤及粘连,HE染色显示异种神经基质膜管组桥接处再生神经结构连续性良好,移植段可见神经纤维及新生的血管.S-100免疫组织化学染色可见阳性的雪旺氏细胞沿神经纤维分布成条带状.电镜超微结构观察可见再生的神经纤维较粗大,排列紧密,呈均匀一致圆型或椭圆型,髓鞘较厚,轴突结构完整.结论 联合应用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)的化学萃取方法构建的异种神经去细胞基质膜管可以修复大鼠坐骨神经缺损.     

PBL教学模式在骨科临床教学中的应用探讨

目的探究PBL教学模式在骨科临床教学中的应用效果。方法选择我院2016年5月—2017年7月在我院实习的实习生88名作为研究对象,按照随机数字表法,将其平均划分为两组,即观察组44名选择问题学习法(PBL)教学模式,对照组44名选择灌输式教学(LBL)教学模式,比较两种教学模式的应用效果。结果 (1)观察组实习生专业知识和临床技能考核成绩均高于对照组实习生,两组数据经对比,差异具有统计学意义(P 0.05);(2)观察组实习生加强临床能力、提升交流能力、加强查阅文献的兴趣、满意教学方法、满意学习氛围和提升科研兴趣比例高于对照组实习生,组间数据经对比,差异具有统计学意义(P 0.05)。结论骨科临床教学中采用PBL教学模式效果良好。     

组织工程神经支架修复周围神经缺损的应用与前景

周围神经缺损过去一直是困扰医学界的难题,组织工程神经支架的出现为周围神经缺损的修复开辟了广阔的前景和思路。将神经支架修复神经缺损的研究进展作一综述,并通过分析指出:复合型组织工程神经支架在长段神经缺损的修复中在理论和实际上具有明显的优势是未来本领域的研究发展方向。     

大鼠坐骨神经缺损修复中应用新型可降解材料的可行性研究

目的：探讨新型的人工合成的可降解材料Poly(DL-laetide-co-ε-caprolac-tone)修复周围神经损伤的可行性。方法：将Poly(DL-laetide-co-ε-caprolac-tone)用特殊方法制成长10mm．内径1．3mm，壁厚0．5mm的神经套管。健康成年SD大鼠24只，随机分为3组，每组8只。实验组用Poly(DL-lactide-co-ε-caprolac-tone)神经套管，对照I组用自体神经移植，对照Ⅱ组用硅胶管桥接。3组均修复5mm长坐骨神经缺损，术后3个月分别观察3组大鼠的足跟溃疡时间、步态、关节活动。计算坐骨神经指数(sciatic nerve function index，SFI)，测量坐骨神经动作电位的潜伏期、波幅和传导速度。并行常规苏木精-伊红(HE)染色和S-100免疫组织化学染色(常规ABC法)，以及运动终板的免疫组织化学和透射电镜观察超微结构。结果：实验组术后3个月各组坐骨神经动作电位的波幅和传导速度与对照Ⅱ组比较，差异有显著性意义；HE染色显示神经套管桥接处神经结构连续性良好，移植段可见神经纤维通过，同时可见新生的血管。S-100免疫反应阳性的雪旺氏细胞沿神经纤维分布成条带状。运动终板乙酰胆碱酯酶阳性反应加深。于腓肠肌的中上部形成终板带，经结合镀银染色可见再生神经束及发出的分支与运动终板相连。电镜观察超微结构接近正常的运动终板。结论：Poly(DL-lactide-co-ε-caprolac-tone)导管可以修复神经缺损，可进一步研究其构建组织工程化人工神经的可能性。