DNA-PKcs单链抗体DPK3-scFv的原核表达纯化及生物学作用研究

目的原核表达和纯化DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)单链抗体DPK3-scFv,观察其透入细胞及干扰辐射诱发DNA-PKcs磷酸化修饰的生物学作用。方法 PCR扩增DPK3-scFv基因,插入到带有His标签的原核表达载体pET28a,重组质粒转化工程菌BL21、优化表达。免疫荧光显微镜和蛋白免疫印迹观察DPK3-scFv透膜进入HeLa细胞及对电离辐射诱发靶分子DNA-PKcs的磷酸化修饰的影响。结果成功构建单链抗体表达载体pET28a-DPK3-scFv,在2xYT培养基(16 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g NaCl溶于1 L双蒸水中,高压灭菌)、20℃温度、0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropy1-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)条件下诱导可溶性表达,进一步获得了纯化单链抗体。DPK3-scFv能体外抑制DNA-PKcs激酶活性,纯化的DPK3-scFv可跨膜进入细胞内,并与DNA-PKcs共定位在细胞核。DPK3-scFv对γ射线照射HeLa细胞中DNA-PKcs及其S2056位点(pS2056)的自磷酸化具有显著抑制作用。结论通过优化条件获得了可溶性原核表达的DPK3-scFv单链抗体,具有抑制其靶分子DNA-PKcs的磷酸激酶活性。     

60Co γ射线诱导正常人淋巴母细胞PIG3 基因mRNA表达的剂量相关性研究

目的 探讨正常人淋巴母细胞AHH1电离辐射作用后PIG3基因mRNA表达变化的剂量-效应规律,建立一种基于基因表达变化的新型辐射生物剂量计的可能性。方法 激光共聚焦检测DNA双链断裂分子标记γ-H2AX集簇点,1、2、4、6、8和10 Gy ⁶⁰Co γ射线照射AHH1细胞后4、10和24 h收集细胞,应用实时荧光定量PCR技术对PIG3基因mRNA表达水平进行相对定量检测。结果 γ射线照射后30 min检测发现PIG3蛋白与γ-H2AX在细胞核内有部分共定位,形成集簇点(foci),表明其参与电离辐射致DNA双链断裂损伤信号识别反应。γ射线诱导PIG3基因 mRNA表达水平随时间推移不断提高,持续时间可达24 h。PIG3基因mRNA表达水平具有显著的剂量依赖性,其表达丰度变化的剂量依赖范围在照射后4 h为0~ 6 Gy、照射后10和24 h均为0~10 Gy。结论 PIG3基因参与DNA双链断裂损伤信号识别反应,其mRNA的辐射诱导表达具有良好的剂量-效应关系,具有发展成为新的放射生物剂量计的价值。     

沉默Krüppel样因子5对电离辐射后大鼠小肠上皮IEC-6细胞生物学功能的影响

目的 探讨沉默Krüppel样因子5（KLF5）对电离辐射后体外培养的大鼠小肠上皮IEC-6细胞生物学功能的影响。方法 给予大鼠小肠上皮IEC-6细胞12 Gy照射,分别在照后0、0.5、1、2、3、5、7、24 h,检测KLF5的表达。给予IEC-6细胞0、2、4、8、12和16 Gy X射线照射,照后3 h收集细胞蛋白,采用Western blot法检测IEC-6细胞中KLF5的表达。设计并合成特异性针对大鼠KLF5基因的shRNA靶序列,构建到慢病毒载体中,通过感染人胚肾293T细胞,对慢病毒进行包装和滴度测定。使用包装好的慢病毒感染IEC-6细胞,荧光显微镜下观察转染效率,转染72 h后分别采用实时-PCR和Western blot方法检测感染后细胞中KLF5 mRNA及蛋白的表达。后续实验分为阴性对照组、shKLF5组、单纯照射组、照射+shKLF5组4组。采用CCK-8法观察8 Gy照射后KLF5沉默细胞的增殖活性,流式细胞术检测8 Gy照射后KLF5沉默细胞的周期分布和凋亡,免疫荧光染色观察2 Gy照射后KLF5沉默细胞中γ-H2AX焦点数量。结果 不同剂量射线照射后KLF5表达逐渐增加,呈现明显的剂量效应关系。12 Gy照射后KLF5表达呈现先升高后降低的趋势,照后5 h表达量最高。KLF5 shRNA慢病毒载体构建成功,感染的IEC-6细胞中KLF5 mRNA及蛋白水平均在转染72 h明显降低。照射+shKLF5组细胞在照射后24 h阻滞在G₂/M期现象显著（t=11.56,P<0.05）,细胞增殖明显受到抑制,其细胞凋亡率（12.49±0.63）%,明显高于单纯照射组（7.42±0.49）%,两组比较差异有统计学意义（t=10.98,P<0.05）,照射+shkLF5组细胞核中各时间点的γ-H2AX焦点数量明显多于同一时间点阴性对照组（t=22.07、23.89、11.24、59.97、20.85,P<0.05）。结论 成功构建KLF5 shRNA慢病毒载体,并建立KLF5敲低小肠上皮细胞株。下调细胞内KLF5表达,能够使细胞周期阻滞在G₂/M期,抑制照射后细胞的增殖,促进细胞的凋亡,DNA双链断裂水平增加,修复延迟。     

DNA-PKcs单链抗体DPK3-scFv的原核表达纯化及生物学作用研究

目的原核表达和纯化DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs）单链抗体DPK3-scFv,观察其透入细胞及干扰辐射诱发DNA-PKcs磷酸化修饰的生物学作用。方法 PCR扩增DPK3-scFv基因,插入到带有His标签的原核表达载体pET28a,重组质粒转化工程菌BL21、优化表达。免疫荧光显微镜和蛋白免疫印迹观察DPK3-scFv透膜进入HeLa细胞及对电离辐射诱发靶分子DNA-PKcs的磷酸化修饰的影响。结果成功构建单链抗体表达载体pET28a-DPK3-scFv,在2xYT培养基（16 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g NaCl溶于1 L双蒸水中,高压灭菌）、20℃温度、0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropy1-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）条件下诱导可溶性表达,进一步获得了纯化单链抗体。DPK3-scFv能体外抑制DNA-PKcs激酶活性,纯化的DPK3-scFv可跨膜进入细胞内,并与DNA-PKcs共定位在细胞核。DPK3-scFv对γ射线照射HeLa细胞中DNA-PKcs及其S2056位点（pS2056）的自磷酸化具有显著抑制作用。结论通过优化条件获得了可溶性原核表达的DPK3-scFv单链抗体,具有抑制其靶分子DNA-PKcs的磷酸激酶活性。     

Tat蛋白与Plk1相互作用位点的鉴定

目的确定Tat蛋白与Plk1的相互作用及作用位点。方法构建tat和plk1基因的不同表达载体,通过GST-pull down、免疫共沉淀检测它们表达产物的相互作用位点,激光共聚焦确定其在细胞内的定位。结果 GST-pull down和免疫共沉淀实验发现Tat蛋白能结合在Plk1 N端的激酶区域,激光共聚焦发现Tat蛋白和Plk1在细胞核内有相同的亚细胞定位。结论 Tat蛋白能结合在Plk1 N端的激酶区域引起Plk1 T210的磷酸化水平提高,从而激活Plk1的活性,导致细胞周期的紊乱。