大分子BAC基因打靶载体转染鸡胚原始生殖细胞

背景：利用原始生殖细胞技术可以方便地将各种外源基因转入鸡体内,以较快的速度获得转基因鸡,但到目前为止原始生殖细胞的转染效率仍然很低,且很难进行较大基因片段的转染。 目的：拟实现大分子BAC载体对鸡胚原始生殖细胞的转染。 设计、时间及地点：基因水平的细胞学体外观察,于2006-08/2008-07在广东省佛山大学完成。 材料：种蛋来自华南农业大学鸡场粤黄鸡群,受精蛋在37.5 ℃、相对湿度为65%的条件下孵化68~72 h。BAC-TDN-GID载体由佛山大学分子生物学实验室保存。 方法：以rRNA基因及其间隔序列作为同源重组引导序列,构建含GFP基因和hIFN基因的大分子BAC基因打靶载体,将鉴定为阳性的载体进行扩增培养并大量抽提。取课题组孵化至第19期的粤黄鸡胚,挑取其生殖嵴或性腺,胰酶消化法获得原始生殖细胞,并辅以饲养层和生长因子进行培养。采用脂质体介导法在原始生殖细胞内进行基因转移,对存活的细胞进行目的基因DNA水平和RNA水平鉴定。 结果：第19期鸡胚性腺原始生殖细胞体外培养48 h呈桑椹状或者椭圆状,72 h形成细胞集落,过碘酸染色呈紫红色。分子量达30 kb的大分子转基因载体BAC-TDN-GID转染鸡胚原始生殖细胞48 h可见荧光细胞,表明转染成功。经PCR和RT-PCR鉴定,证实扩增的产物大小与预期结果大致相吻合,目的基因hIFN已经整合进入原始生殖细胞基因组,并已开始表达。 结论：实验成功将大分子BAC载体上的外源基因转染入体外分离培养的鸡胚原始生殖细胞。     

卵巢移植和冷冻保存技术在生殖领域中的应用

卵子是一种宝贵的生殖资源，它不象精子那样易获得和好保存，过去关于保存母本遗传物质的研究主要倾向于冷冻保存卵母细胞的方式，而对其它的一些保存方式，如：卵巢移植和卵巢冷冻保存的方法研究相对较少，并且这两种方法在近来也成为生殖领域中的研究热点，本文就主要根据自己在这方面的一些简单研究，做一点关于卵巢移植和冷冻保存的简单综述。     

大分子BAC基因打靶载体转染鸡胚原始生殖细胞

背景:利用原始生殖细胞技术可以方便地将各种外源基因转入鸡体内,以较快的速度获得转基因鸡,但到目前为止原始生殖细胞的转染效率仍然很低,且很难进行较大基因片段的转染.目的:拟实现大分子BAC载体埘鸡胚原始生殖细胞的转染.设计、时间及地点:基因水平的细胞学体外观察,于2006-08/2008-07在广东省佛山大学完成.材料:种蛋来自华南农业大学鸡场粤黄鸡群,受精蛋在37.5℃、相对湿度为65%的条件卜孵化68～72 h.BAC-TDN-GID 载体由佛山大学分子生物学实验室保存.方法:以rRNA基因及其间隔序列作为同源重组引导序列,构建含GFP基因和hlFN基因的大分子BAC基因打靶载体,将鉴定为阳性的载体进行扩增培养并大昔抽提.取课题组孵化至第19期的粤黄鸡胚,挑取其生殖嵴或性腺,胰酶消化法获得原始生殖细胞,并辅以饲养层和生长因子进行培养.采用脂质体介导法在原始生殖细胞内进行基因转移,对存活的细胞进行目的基因DNA水平和RNA水平鉴定. 结果:第19期鸡胚件腺原始生殖细胞体外培养48 h呈桑椹状或者椭圆状,72 h形成细胞集落,过碘酸染色呈紫红色.分子量达30 kb的大分子转基冈载体BAC-TDN-GID转染鸡胚原始生殖细胞48 h可见荧光细胞,表明转染成功.经PCR和RT-PCR鉴定,证实扩增的产物大小与预期结果大致相吻合,目的基囚hlFN已经整合进入原始生殖细胞基因组,并已开始表达.结论:实验成功将大分子BAC载体上的外源基因转染入体外分离培养的鸡胚原始生殖细胞.     

免疫瘦素受体胞外近跨膜区重组融合蛋白对SD大鼠脂肪沉积的影响

目的原核表达瘦素受体（OBR）近跨膜区重组融合蛋白并进行SD大鼠免疫实验,观察其对SD大鼠脂肪沉积的影响。方
法设计1对带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点特异性引物,扩增OBR胞外近跨膜区基因片段（1705~2364 bp）,经酶切后连接到
表达载体pRSETA的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建OBR胞外近跨膜区重组表达质粒并在大肠杆菌E.coli BL21
（DE3）中表达,SDS-PAGE电泳分析和western blotting鉴定表达产物。随后制备OBR胞外近跨膜区重组融合蛋白并免疫SD大
鼠,观察其对SD大鼠体质量、采食量、体长、Lee’s指数、腹脂率、肝脏脂肪沉积、皮下脂肪沉积的影响。结果SDS-PAGE电泳分
析和Western blotting鉴定结果显示,在IPTG诱导下OBR胞外近跨膜区重组表达菌表达了相对分子质量27 600左右的融合蛋
白。对SD大鼠免疫OBR胞外近跨膜区重组融合蛋白后,体质量、体长、Lee’s指数、腹脂率、肝脏脂肪沉积与对照组无明显差异,
而采食量显著增加、皮下脂肪细胞体积减小。结论成功表达西藏小型猪瘦素受体胞外近跨膜区重组融合蛋白,免疫SD大鼠可
促进采食和抑制皮下脂肪沉积。
     

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的 克隆及原核表达西藏小型猪瘦素(Leptin)成熟肽及瘦素受体胞外区片段.方法 根据西藏小型猪瘦素序列(GenBank号:GQ240885.1)和猪瘦素受体基因胞外域序列(GenBank号:AF167719.1)分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得了特异性片段.再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanH Ⅰ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位(成熟肽编码区)和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD<,18>-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存.此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamH Ⅰ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物.结果 在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×10<'3>左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×10<'3>左右的融合蛋白.结论 说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21(DE3)中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础.