弓形虫微线体蛋白MIC2和M2AP真核表达载体的构建

目的构建弓形虫RH株微线体蛋白M2AP和MIC2的真核表达载pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,为建立同时表达MIC2和M2AP蛋白的重组毕赤酵母表达系统,制备重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP奠定基础。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,用Oligo dT-Adaptor引物逆转录合成cDNA。根据已知的弓形虫mic2和m2ap基因序列,采用引物设计软件Primer premier5.0自行设计并合成引物,以cDNA为模板,PCR扩增mic2和m2ap基因,克隆入pMD-19-simple-T载体,经酶切和测序鉴定后回收目的片段,分别插入至pGAPZαA内,构建重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,转化入E.coli DH5α。提取转化菌质粒,进行酶切和测序鉴定。结果 PCR扩增得到的mic2和m2ap基因分别为2 200bp和1 000bp,与预期大小一致。T-A克隆重组质粒pMD19-T-mic2、pMD19-T-m2ap和重组酵母表达质粒pGAPZαA-mic2、pGAPZαA-m2ap经测序鉴定,与GenBank收录的弓形虫mic2基因和m2ap基因序列同源性为100%,重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap构建成功。结论成功构建弓形虫重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,为进一步研究MIC2和M2AP相互作用机制及其免疫保护效应奠定了基础。     

弓形虫重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP的制备、鉴定及免疫保护效应

【立论依据】 弓形虫微线体分泌的粘附蛋白MIC2与M2AP(MIC2相关蛋白)以1∶1的比例形成MIC2-M2AP六聚复合体,转移到弓形虫顶端与宿主细胞膜之间形成的连接区域,协助虫体进入宿主细胞。 【设计思路】 制备弓形虫重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP,鉴定其免疫原性和免疫反应性及其在抗弓形虫入侵宿主细胞中的作用,为筛选MIC2-M2AP作为弓形虫疫苗候选抗原的研究奠定基础。 【实验内容】 RT-PCR扩增弓形虫MIC2和M2AP基因,克隆至组成型表达的毕赤酵母表达载体pGAPZαA中,构建重组真核表达质粒 pGAPZαA-MIC2和pGAPZαA-M2AP,利用同源重组的方法将MIC2和M2AP基因整合到同一毕赤酵母细胞X33的基因组中进行发酵表达获得重组MIC2-M2AP复合体,His标签Ni-NTA柱亲和层析纯化后免疫小鼠,采用免疫小鼠血清和弓形虫感染鼠血清进行蛋白质印迹鉴定重组MIC2-M2AP复合体的免疫原性和免疫反应性,免疫小鼠抗重组MIC2-M2AP复合体多抗血清体外中和实验观察阻断弓形虫入侵宿主细胞效应,重组MIC2-M2AP复合体免疫小鼠的抗弓形虫感染效应。 【材料】 弓形虫RH株速殖子,毕赤酵母表达载体pGAPZαA。 【可行性】 国外文献已经证实MIC2-M2AP复合体在协助虫体的滑移运动和侵入细胞中发挥重要的作用,敲除MIC1基因后,弓形虫株对宿主细胞的入侵率下降50%,敲除MIC2的结合蛋白M2AP后,弓形虫株对宿主细胞的入侵率下降80%以上,因此重组MIC2-M2AP复合体有可能作为弓形虫疫苗候选抗原。目前我们已成功构建了重组真核表达载体 pGAPZαA-MIC2和pGAPZαA-M2AP,其核苷酸序列与GenBank中的序列同源性为100%。 【创新性】 国内外在弓形虫疫苗候选抗原筛选研究中,目前报道较多的是弓形虫表面抗原(SAG)、棒状体蛋白(ROP)、致密颗粒抗原(GRA)等可能作为弓形虫疫苗候选抗原的研究,而关于微线体蛋白(MIC)尤其是MIC2-M2AP复合体可作为弓形虫疫苗候选抗原的研究未见报道,而根据已报道的微线体蛋白相关研究成果,我们推测重组MIC2-M2AP复合体免疫会产生较强的免疫保护效果。